ATAC-seq学习记录

ATAC-seq意义

• 为何同样DNA序列的细胞的表型会不同，为何肝细胞是肝细胞，神经细胞是神经细胞？是什么造成了他们生产蛋白不同，决定蛋白生成的RNA不同呢？原因可以用表观遗传来解释。
  
• DNA转录成RNA过程复杂，包括：染色质可及性，DNA修饰，组蛋白修饰等等（选择性表达）。
• 染色质可及性即DNA开放区域，尤为重要。核小体由8个组蛋白组成复合物，每个核小体约147bpDNA。转录时DNA将从核小体复合物松开。许多因素，如染色质结构、核小体位置和组蛋白修饰，在染色质的组织和可及性起重要作用。致密核小体结构被破坏后，启动子、增强子、绝缘子、沉默子等顺式调控元件和反式作用因子可以接近的特性，叫染色质的可及性，也叫染色质开放性(chromatin accessibility ），这段区域叫开放染色质（open chromatin） 。
• 什么是组蛋白修饰
  • 定义：组蛋白包含5个部分，按分子量大小分别称为H1，H3，H2A，H2B和H4。组蛋白在相关酶作用下发生甲基化，乙酰化，磷酸化，腺苷酸化，泛素化，ADP核糖基化等修饰
  • H3·H4乙酰化形成开放染色质结构，增加基因表达
  • 组蛋白甲基化修饰多发生在H3H4，与基因抑制及激活相关，取决于被修饰的位置和程度
  • 组蛋白磷酸化修饰一般与基因活化有关
  • 组蛋白泛素化则是启动基因表达
• ATAC-seq检测染色质可及性，确定基因表达调控机制。识别启动子区域、潜在的增强子或抑制子。启动子是靠近转录起始点(TSS)的DNA区域。包含转录因子的结合位点，转录因子招募RNA聚合酶。增强子是位于启动子下游或上游1Mb的DNA区域。当转录因子与增强子结合，并与启动子区域接触时，该基因的转录增加。相反抑制子会减少或抑制基因表达。
• ATAC-seq的峰往往是启动子，增强子序列以及一些反式调控因子结合位点。
• 2013年由斯坦福大学William J. Greenleaf和Howard Y. Chang实验室开发的ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing），一种捕获染色质可及性（染色质开放性）的测序方法。
• 为找到开放染色质区，基因组被TN5转座酶处理。在ATAC-Seq中，修饰后的TN5将与NextEra接头相对应的DNA序列插入到基因组的开放区域，同时，DNA被转座酶活性剪切。
• 开放染色质的研究方法除了ATAC-seq，还有DNase-Seq，FAIRE-seq，MNase-seq 等。ATAC-Seq所需样本少，建库快，重复性更高
  
• 故ATAC-seq与Chip-seq call出来的peak代表的意义不同。Chip-seq peak是被目的蛋白结合拉下来的DNA，一般只有一个峰，而ATAC-seq是被Tn5转座酶切开、没有被组蛋白结合、染色质开放的DNA位点，如果是TF结合的区域，一般会有一个山谷般的存在。ChIP-seq和ATAC-seq在TF或者Tn5结合区域都会形成一个双峰的reads结合模式，但判断peak的时会有不同的标准。chip-seq是由于TF一起沉淀下来的DNA fragment一般会大于TF的结合区域，read的位置并不是真实TF结合位置，需要向内shift；而ATAC-seq一般是往两边shift。
  

应用上的区别

• ATAC-Seq可检测全基因组DNA结合蛋白，转录结合位点 ，一般用于不知道特定的转录因子，用此方法与其他方法结合筛查感兴趣的特定调控因子；

• ChIP-Seq是已知转录因子，根据感兴趣的转录因子设计抗体去做ChIP实验富集结合的DNA片段。在测定转录因子的 ChIP-seq 中独有的峰可能是先驱转录因子，其先结合到封闭染色质，然后招募染色质重塑因子或其他转录因子起始转录。这些转录因子 ATAC-seq检测不到。

• 得到DNA片段后，为测序准备建库，包括用完整的NextEra接头和纯化、PCR扩增等。基于上述原因，ATAC-Seq推荐使用双端配对的方法。

应用

• 染色质开放性图谱绘制，表观基因组图谱
• 找调控生物学过程的关键转录因子
• 找哪个转录因子调控了研究的基因
• 找转录因子调控的靶基因
• 得到不同组织或不同条件下对应可及性区域。
• 得到核小体位置
• 生成转录因子结合区域的特征(footprinting)

技术限制

• Tn5通过插入剪断DNA 并将测序接头连接到剪断的两个DNA 片段的末端，因此对于一个DNA 片段而言，其两端的接头连接是随机的，导致同一片段两端的接头有50%的概率是同一接头。而只有连接不同接头的片段才可用于富集扩增及测序，因此一半的片段无法利用；
• 大量剪断的DNA 由于片段过大，无法进行PCR富集;
• Tn5 的活性受反应溶液的组成及反应条件影响，仍然需要优化以便提高剪切效果；
• ATAC-seq在植物细胞存在以下难点：细胞壁，叶绿体线粒体等细胞器污染，缺少稳定遗传的细胞系;

ATAC-Seq、Dnase-Seq、MNase-Seq、FAIRE-Seq

• 整体的分析思路一致，找富集区域，对富集区域进行功能分析。
• ChIP-Seq是揭示特定转录因子或蛋白复合物的结合区域，实际是研究DNA和蛋白质的相互作用，利用抗体将蛋白质和DNA一起富集，并对富集的DNA测序。
• DNase-Seq、ATAC-Seq、FAIRE-Seq都研究开放染色质区域：
• DNase-Seq用DNase I内切酶识别开放染色质区域，
• ATAC-seq用Tn5转座酶，随后进行富集扩增；
• FAIRE-Seq先超声裂解，后用酚-氯仿富集；
• MNase-Seq鉴定核小体区域。

下图是不同测序方法获取的峰形：

检测染色质可及性的方法中，ATAC-seq尤其受欢迎。

• ATAC-seq的优点：Tn5转座酶的高活性使ATAC-seq简单，省时，而且只需500-50,000个细胞。灵敏度特异性与DNase-seq相当，优于FAIRE-seq。

整合分析

• 由于开放染色质是大多数TF结合的先决条件，因此ATAC-seq峰通常与TF ChIP-seq峰重叠，但通常更宽。因此，TF ChIP-seq和ATAC-seq可以在同一实验系统中相互验证彼此的质量和可靠性。

• ATAC-seq与 histone marker ChIP-seq集成，发现与活跃染色质标 H3K4me3，H3K4me1，H3K27ac等正相关，与不活跃的染色质标记 H3K27me3 负相关。 ？

• ATAC-seq+RNA-seq： 一般RNA-seq会优先于ATAC-seq先测，但差异基因富集的基因通路只是一种相关性。要分析出其中谁调控目的基因，可通过ATAC-seq做motif分析，寻找潜在的调控因子，然后再后续的实验验证或者chip-seq验证。/ 看ATAC上丰度高的DNA序列区域是否对应转录本表达量增加，找到对应转录本相关基因的上游调控序列，整体分析转录。对基因功能分析，结合实验表型，推测表达调控-表达-功能-表型。
  

• ATAC-seq+HiC： 对于一些想了解染色质高级结构对生命行为的作用的时候，通常会需要用到ATAC-seq等技术，因为Hi-C分析得到高级结构compartmentA/B、TADs、Loops等信息，通常只是相关性，但通过ATAC-seq，可以获得promoter、enhancer等信息，更能知道高级结构是如何影响启动子、增强子从而影响基因表达的。
  

• ATAC-seq+组蛋白修饰： ATAC-seq预测一个位点的开放程度以及可能有某种转录因子的结合，但不知道该因子是促进基因表达，还是抑制，只通过基因层面鉴定来判断转录因子对基因的促进或者是不够的，它只是一种相关性。而这时候如果能提供像H3K27ac这类激活型组蛋白、H3K27me3这类抑制型组蛋白将能使数据结果可信。国内较早研究iPSCs的学者如裴端卿的工作可以看到，在解析iPSCs重编程中的染色质可及性的时候，不仅用到ATAC-seq来描述细胞的身份转变，还通过H3K27ac指征该区域的激活。其中一篇还通过调控成纤维细胞关键基因启动子区去乙酰化修饰，达到了促进重编程的进程。
  

• scATAC-seq+scRNA-seq： 更前沿的技术一个细胞里同时进行RNA-seq和ATAC-seq，并且是单细胞水平的检测。SHARE-seq，能够实现在单细胞中同时高质量，高通量的检测基因表达和染色质可及性。该技术可以使用染色质潜力算法（chromatin potential），用ATAC和RNA的差异来预测细胞的变化方向。相对于以往仅依赖于RNA的预测手段，染色质潜力能够大大提前预测的时间。
  

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• 思考：
• ATAC-Seq与ChIP-Seq的异同在哪里？
• 用和ChIP-Seq一样的参数Call peaks正确吗？
• 得到peaks后怎么进行质量评估？
• 样本内的重复怎么处理？
• 样本间的差异怎么分析？
• 怎么对peaks进行功能注释分析？
• 如何找motif?
• ATAC-Seq和ChIP-Seq和RNA-Seq的整合分析怎么做？
• 待学习：Harvard Chan Bioinformatics Core (HBC)深度NGS数据分析课程，第5部分关于ChIP-Seq，整体思路和绝大部分分析方法适合ATAC-seq。
  

待学习内容：

1. ATAC-seq data analysis: from FASTQ to peaks
2. ATAC-seq Data Standards and Processing Pipeline in ENCODE
3. ATAC-seq数据分析实战
4. Harvard FAS Informatics - ATAC-seq Guidelines

HBC深度NGS数据分析课程：
https://github.com/hbctraining/In-depth-NGS-Data-Analysis-Course
第五部分ChIP-Seq课程：
5. https://github.com/hbctraining/In-depth-NGS-Data-Analysis-Course/tree/master/sessionV/lessons

1：ATAC-seq的背景介绍以及与ChIP-Seq的异同
2：原始数据的质控、比对和过滤
3：用MACS2软件call peaks
4：对ATAC-Seq/ChIP-seq的质量评估（一）——phantompeakqualtools
5：对ATAC-Seq/ChIP-seq的质量评估（二）——ChIPQC
6：重复样本的处理——IDR
7：用Y叔的ChIPseeker做功能注释
8：用网页版工具进行motif分析
9：差异peaks分析——DiffBind
10：ATAC-Seq、ChIP-Seq、RNA-Seq整合分析

参考文献：
https://mp.weixin.qq.com/s?src=11×tamp=1633159169&ver=3349&signature=*MwqLr1J-qdZoNiKVxF32vEKh5-6TRystOXAJ3UOZ3Pl8XTBIB8Ly95IJM0L2EzGFVWOM-TdKnuhnb0gfMfsUTfahWJ5i3hcM2TcR9UDFSVWuyYw7CONzMjsMaYQG2Ca&new=1
https://mp.weixin.qq.com/s?src=11×tamp=1633159169&ver=3349&signature=rtYw5NsC62rUZvctQsUg3*w*NFFDdOHgSMu0pcp0HTQdCyqxpgril8yx7GWlJaID*lfd2HRLUWs59zuszSEFeean0jEwdRs4PzYy*T5b7nSpZRWqCs4SHcEQ2jyjDtwQ&new=1

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简洁版ATACseq分析流程

• 数据预处理
  • （1）比对前质量控制FastQC
  • （2）原始序列比对
  • （3）比对后处理和质量控制：去除重复序列，细胞器序列
    • 序列比对后，Picard/SAMtools收集unique mapping reads/rate，duplicated rate百分比和片段大小分布
    • 成功的ATACseq实验应生成片段大小分布图（从bam文件得到），具有递减性和周期性的峰，对应于无核小体区域（NFR）（<100bp）和单核双核和三核小体（200，400，600bp）。大多数Linker DNA大小介于10-80bp间，故大多数片段都会是小于100bp。每个Nucleosome的DNA大小为180bp，加上两边插入的冗余，会得到大约200bp长度的mono-nucleosome的DNA。
    • 无核小体区域的片段应该在基因的转录起始位点（TSS）周围富集，而核小体结合区域片段TSS处形成低谷，TSS周围侧翼区域稍微富集。ATACseqQC评估。
• Peak-calling：从比对得到的bam文件找出reads覆盖区，就是峰出现的位置。
• 高级分析
  • （1）peak 差异分析：寻找不同分组差异peaks
  • （2）peak注释：峰的注释可将染色质的可及性与基因调控联系。通常峰会被注释到最接近的基因或调控原件。获得最接近的基因列表后，使用GOKEGGReactome等数据库功能富集分析
  • （3）motif富集分析：得到每个peak region里motif的位置和频率，再和随机背景或其他条件比较，可做motif富集分析
  • （4）footprint分析 ：ATACseq中footprint指一个TF结合在DNA上，组织Tn5切割，在染色质开放区域留下一个相对缺失的位置。而TF周围的组蛋白因为TF造成空间的推挤反而形成开放度较高区域。

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