ATAC-seq学习记录

ATAC-seq意义

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  • 为何同样DNA序列的细胞的表型会不同,为何肝细胞是肝细胞,神经细胞是神经细胞?是什么造成了他们生产蛋白不同,决定蛋白生成的RNA不同呢?原因可以用表观遗传来解释。
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  • DNA转录成RNA过程复杂,包括:染色质可及性DNA修饰组蛋白修饰等等(选择性表达)。
  • 染色质可及性即DNA开放区域,尤为重要。核小体8个组蛋白组成复合物,每个核小体约147bpDNA。转录时DNA将从核小体复合物松开。许多因素,如染色质结构核小体位置组蛋白修饰,在染色质的组织和可及性起重要作用。致密核小体结构被破坏后,启动子、增强子、绝缘子、沉默子顺式调控元件和反式作用因子可以接近的特性,叫染色质的可及性,也叫染色质开放性(chromatin accessibility ),这段区域叫开放染色质(open chromatin) 。
  • 什么是组蛋白修饰
    • 定义:组蛋白包含5个部分,按分子量大小分别称为H1,H3,H2A,H2B和H4。组蛋白在相关酶作用下发生甲基化,乙酰化,磷酸化,腺苷酸化,泛素化,ADP核糖基化等修饰
    • H3·H4乙酰化形成开放染色质结构,增加基因表达
    • 组蛋白甲基化修饰多发生在H3H4,与基因抑制及激活相关,取决于被修饰的位置和程度
    • 组蛋白磷酸化修饰一般与基因活化有关
    • 组蛋白泛素化则是启动基因表达
  • ATAC-seq检测染色质可及性确定基因表达调控机制。识别启动子区域潜在的增强子或抑制子启动子是靠近转录起始点(TSS)的DNA区域。包含转录因子的结合位点,转录因子招募RNA聚合酶。增强子是位于启动子下游或上游1Mb的DNA区域。当转录因子与增强子结合,并与启动子区域接触时,该基因的转录增加。相反抑制子减少或抑制基因表达
  • ATAC-seq的峰往往是启动子,增强子序列以及一些反式调控因子结合位点。
  • 2013年由斯坦福大学William J. Greenleaf和Howard Y. Chang实验室开发的ATAC-seq(Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing),一种捕获染色质可及性(染色质开放性)的测序方法。
  • 为找到开放染色质区,基因组被TN5转座酶处理。在ATAC-Seq中,修饰后的TN5将与NextEra接头相对应的DNA序列插入到基因组的开放区域,同时,DNA被转座酶活性剪切。
  • 开放染色质的研究方法除了ATAC-seq,还有DNase-Seq,FAIRE-seq,MNase-seq 等。ATAC-Seq所需样本少,建库快,重复性更高
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  • ATAC-seqChip-seq call出来的peak代表的意义不同Chip-seq peak是被目的蛋白结合拉下来的DNA,一般只有一个峰,而ATAC-seq是被Tn5转座酶切开、没有被组蛋白结合、染色质开放的DNA位点,如果是TF结合的区域,一般会有一个山谷般的存在。ChIP-seq和ATAC-seq在TF或者Tn5结合区域都会形成一个双峰的reads结合模式,但判断peak的时会有不同的标准。chip-seq是由于TF一起沉淀下来的DNA fragment一般会大于TF的结合区域read的位置并不是真实TF结合位置,需要向内shift;而ATAC-seq一般是往两边shift
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应用上的区别
  • ATAC-Seq可检测全基因组DNA结合蛋白转录结合位点 ,一般用于不知道特定的转录因子,用此方法与其他方法结合筛查感兴趣的特定调控因子

  • ChIP-Seq是已知转录因子,根据感兴趣的转录因子设计抗体去做ChIP实验富集结合的DNA片段。在测定转录因子的 ChIP-seq 中独有的峰可能是先驱转录因子,其先结合到封闭染色质,然后招募染色质重塑因子或其他转录因子起始转录。这些转录因子 ATAC-seq检测不到

  • 得到DNA片段后,为测序准备建库,包括用完整的NextEra接头纯化PCR扩增等。基于上述原因,ATAC-Seq推荐使用双端配对的方法。

应用

  • 染色质开放性图谱绘制,表观基因组图谱
  • 调控生物学过程的关键转录因子
  • 哪个转录因子调控了研究的基因
  • 找转录因子调控的靶基因
  • 得到不同组织或不同条件下对应可及性区域
  • 得到核小体位置
  • 生成转录因子结合区域的特征(footprinting)

技术限制

  • Tn5通过插入剪断DNA 并将测序接头连接到剪断的两个DNA 片段的末端,因此对于一个DNA 片段而言,其两端的接头连接是随机的,导致同一片段两端的接头有50%的概率是同一接头。而只有连接不同接头的片段才可用于富集扩增及测序,因此一半的片段无法利用
  • 大量剪断的DNA 由于片段过大,无法进行PCR富集;
  • Tn5 的活性受反应溶液的组成及反应条件影响,仍然需要优化以便提高剪切效果;
  • ATAC-seq在植物细胞存在以下难点细胞壁叶绿体线粒体等细胞器污染缺少稳定遗传的细胞系;

ATAC-Seq、Dnase-Seq、MNase-Seq、FAIRE-Seq

  • 整体的分析思路一致,找富集区域,对富集区域进行功能分析。
  • ChIP-Seq是揭示特定转录因子蛋白复合物的结合区域,实际是研究DNA和蛋白质的相互作用,利用抗体将蛋白质和DNA一起富集,并对富集的DNA测序
  • DNase-Seq、ATAC-Seq、FAIRE-Seq都研究开放染色质区域
  • DNase-Seq用DNase I内切酶识别开放染色质区域,
  • ATAC-seq用Tn5转座酶,随后进行富集扩增
  • FAIRE-Seq先超声裂解,后用酚-氯仿富集;
  • MNase-Seq鉴定核小体区域。

下图是不同测序方法获取的峰形:

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检测染色质可及性的方法中,ATAC-seq尤其受欢迎。
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  • ATAC-seq的优点:Tn5转座酶的高活性使ATAC-seq简单,省时,而且只需500-50,000个细胞。灵敏度特异性与DNase-seq相当,优于FAIRE-seq。
整合分析
  • 由于开放染色质是大多数TF结合的先决条件,因此ATAC-seq峰通常与TF ChIP-seq峰重叠,但通常更宽。因此,TF ChIP-seq和ATAC-seq可以在同一实验系统中相互验证彼此的质量和可靠性。

  • ATAC-seq与 histone marker ChIP-seq集成,发现与活跃染色质标 H3K4me3,H3K4me1,H3K27ac等正相关,与不活跃的染色质标记 H3K27me3 负相关。

  • ATAC-seq+RNA-seq: 一般RNA-seq会优先于ATAC-seq先测,但差异基因富集的基因通路只是一种相关性。要分析出其中谁调控目的基因,可通过ATAC-seq做motif分析寻找潜在的调控因子,然后再后续的实验验证或者chip-seq验证。/ 看ATAC上丰度高的DNA序列区域是否对应转录本表达量增加,找到对应转录本相关基因的上游调控序列,整体分析转录。对基因功能分析,结合实验表型,推测表达调控-表达-功能-表型。
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  • ATAC-seq+HiC: 对于一些想了解染色质高级结构对生命行为的作用的时候,通常会需要用到ATAC-seq等技术,因为Hi-C分析得到高级结构compartmentA/B、TADs、Loops等信息,通常只是相关性,但通过ATAC-seq,可以获得promoter、enhancer等信息,更能知道高级结构是如何影响启动子、增强子从而影响基因表达的。
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  • ATAC-seq+组蛋白修饰: ATAC-seq预测一个位点的开放程度以及可能有某种转录因子的结合,但不知道该因子是促进基因表达,还是抑制,只通过基因层面鉴定来判断转录因子对基因的促进或者是不够的,它只是一种相关性。而这时候如果能提供像H3K27ac这类激活型组蛋白H3K27me3这类抑制型组蛋白将能使数据结果可信。国内较早研究iPSCs的学者如裴端卿的工作可以看到,在解析iPSCs重编程中的染色质可及性的时候,不仅用到ATAC-seq来描述细胞的身份转变,还通过H3K27ac指征该区域的激活。其中一篇还通过调控成纤维细胞关键基因启动子区去乙酰化修饰,达到了促进重编程的进程。
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  • scATAC-seq+scRNA-seq: 更前沿的技术一个细胞里同时进行RNA-seq和ATAC-seq,并且是单细胞水平的检测。SHARE-seq,能够实现在单细胞中同时高质量,高通量的检测基因表达和染色质可及性。该技术可以使用染色质潜力算法(chromatin potential),用ATAC和RNA的差异来预测细胞的变化方向相对于以往仅依赖于RNA的预测手段,染色质潜力能够大大提前预测的时间
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  • 思考
  • ATAC-Seq与ChIP-Seq的异同在哪里?
  • 用和ChIP-Seq一样的参数Call peaks正确吗?
  • 得到peaks后怎么进行质量评估?
  • 样本内的重复怎么处理?
  • 样本间的差异怎么分析?
  • 怎么对peaks进行功能注释分析?
  • 如何找motif?
  • ATAC-Seq和ChIP-Seq和RNA-Seq的整合分析怎么做?
  • 待学习:Harvard Chan Bioinformatics Core (HBC)深度NGS数据分析课程,第5部分关于ChIP-Seq,整体思路和绝大部分分析方法适合ATAC-seq。
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待学习内容:

  1. ATAC-seq data analysis: from FASTQ to peaks
  2. ATAC-seq Data Standards and Processing Pipeline in ENCODE
  3. ATAC-seq数据分析实战
  4. Harvard FAS Informatics - ATAC-seq Guidelines

HBC深度NGS数据分析课程:
https://github.com/hbctraining/In-depth-NGS-Data-Analysis-Course
第五部分ChIP-Seq课程:
5. https://github.com/hbctraining/In-depth-NGS-Data-Analysis-Course/tree/master/sessionV/lessons

1:ATAC-seq的背景介绍以及与ChIP-Seq的异同
2:原始数据的质控、比对和过滤
3:用MACS2软件call peaks
4:对ATAC-Seq/ChIP-seq的质量评估(一)——phantompeakqualtools
5:对ATAC-Seq/ChIP-seq的质量评估(二)——ChIPQC
6:重复样本的处理——IDR
7:用Y叔的ChIPseeker做功能注释
8:用网页版工具进行motif分析
9:差异peaks分析——DiffBind
10:ATAC-Seq、ChIP-Seq、RNA-Seq整合分析
参考文献:
https://mp.weixin.qq.com/s?src=11×tamp=1633159169&ver=3349&signature=*MwqLr1J-qdZoNiKVxF32vEKh5-6TRystOXAJ3UOZ3Pl8XTBIB8Ly95IJM0L2EzGFVWOM-TdKnuhnb0gfMfsUTfahWJ5i3hcM2TcR9UDFSVWuyYw7CONzMjsMaYQG2Ca&new=1
https://mp.weixin.qq.com/s?src=11×tamp=1633159169&ver=3349&signature=rtYw5NsC62rUZvctQsUg3*w*NFFDdOHgSMu0pcp0HTQdCyqxpgril8yx7GWlJaID*lfd2HRLUWs59zuszSEFeean0jEwdRs4PzYy*T5b7nSpZRWqCs4SHcEQ2jyjDtwQ&new=1

简洁版ATACseq分析流程

  • 数据预处理
    • (1)比对前质量控制FastQC
    • (2)原始序列比对
    • (3)比对后处理和质量控制:去除重复序列,细胞器序列
      • 序列比对后,Picard/SAMtools收集unique mapping reads/rate,duplicated rate百分比和片段大小分布
      • 成功的ATACseq实验应生成片段大小分布图(从bam文件得到),具有递减性和周期性的峰,对应于无核小体区域(NFR)(<100bp)和单核双核和三核小体(200,400,600bp)。大多数Linker DNA大小介于10-80bp间,故大多数片段都会是小于100bp。每个Nucleosome的DNA大小为180bp,加上两边插入的冗余,会得到大约200bp长度的mono-nucleosome的DNA。
      • 无核小体区域的片段应该在基因的转录起始位点(TSS)周围富集,而核小体结合区域片段TSS处形成低谷,TSS周围侧翼区域稍微富集ATACseqQC评估
  • Peak-calling:从比对得到的bam文件找出reads覆盖区,就是峰出现的位置。
  • 高级分析
    • (1)peak 差异分析:寻找不同分组差异peaks
    • (2)peak注释:峰的注释可将染色质的可及性与基因调控联系。通常峰会被注释到最接近的基因或调控原件。获得最接近的基因列表后,使用GOKEGGReactome等数据库功能富集分析
    • (3)motif富集分析:得到每个peak region里motif的位置和频率,再和随机背景或其他条件比较,可做motif富集分析
    • (4)footprint分析 :ATACseq中footprint指一个TF结合在DNA上,组织Tn5切割,在染色质开放区域留下一个相对缺失的位置。而TF周围的组蛋白因为TF造成空间的推挤反而形成开放度较高区域。

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