lipo3000转染HepG2细胞

HepG2细胞一直是公认的比较难转染的细胞，一般都是采用电转。但我在invitrogen官网看到他们使用lipo3000竟然转染效率可以达到50-60%。出于好奇我也用lipo3000转然后，失败。
失败点主要基于2个，

（1）我以为难转染的细胞在转染前使用无血清处理，使细胞周期持平，这样会比较好转染。而且在转染时使用opti-DMEM会促进转染效率。

答案：错误，此时细胞的培养环境改变，胞膜的渗透性改变，会加大转染难度。而使用opti后的细胞生长环境也发生了变化，会使细胞产生应激，加大转染难度。

（2）转让时质粒过多会造成转染效率过低；

答案：错误，过多最多造成浪费。

总结经验：

（1）最好使用24孔板进行转染，转染完成细胞长满可以传代，这样不会造成lipo浪费。
（2）lipo的用量在预实验时可以调整到说明书的最高与最低，最低看转染效率，最高看细胞耐受（死亡率）
（3）当使用opti稀释lipo，使用P3000稀释DNA时，不需要各自孵育5min，而且两者混合后最多孵育15min；
（4）转然后或者转染中的细胞使用无双抗的完全培养基；
（5）HepG2如果在转染时是80%左右，在转然后就会长满，影响转染效率，最好调整细胞密度为60%时转染。第二天再荧光显微镜下观察，看一下转染效率；

24孔板的转染

A:opti-DMEM 25ul+lipo1.5ul
B：opti 25ul+P3000 2ul+DNA 1ug
混合孵育12min，加入细胞中，细胞中含有无双抗培养基500ul；
6孔板：
A opti 125ul+lipo 7.5ul
B：opti-125ul+P3000 5ul+DNA 5ug
混合孵育12min，加入细胞中，细胞中含有无双抗培养基800ul；