蛋白质SDS-PAGE分子量偏差等问题

  SDS-PAGE是蛋白质分析与鉴定最常用的方法之一，它的特点是一定范围内蛋白质分子量的对数与迁移率线性相关，基于这一点，很多技术人员把SDS-PAGE作为定量检测分子量的手段。实际上，蛋白质在SDS-PAGE中的表观分子量与实际分子量往往有偏差，本文主要聊聊包括分子量偏差在内的三个问题：

1. 不同蛋白质之间能进行分子量比较的原理
     关于SDS-PAGE的原理，网上有很多，千篇一律：在聚丙烯酰胺凝胶中，蛋白质的泳动速率与电荷和体积有关，SDS与蛋白质形成复合物，大量SDS所携带负电荷掩盖了蛋白质原有电荷，并且蛋白质-SDS复合体具有相似的形状（类似雪茄烟的棒状颗粒，我个人认为应该比喻为橄榄球状），电荷的差异消除了，形状也相似，那只有分子量这一个变量了。分子量大的，“个头”大，在凝胶中“行动迟缓”，分子量小的，“个头”小，迁移速率快。实验证明，在一定范围内蛋白质的迁移速率与分子量的对数存在线性关系。
   这里有几篇文献，介绍了SDS-PAGE技术是如何确立的：
   [1] Laver W G. Structural studies on the protein subunits from three strains of influenza virus[J]. Journal of molecular biology, 1964, 9(1): 109-IN9.
   研究人员使用SDS将三种病毒蛋白的亚基解离并通过电泳进行鉴别（这是作者找到的最早使用SDS-PAGE分析多肽链的文献）
   [2] Shapiro, A. L., Viñuela, E., & V. Maizel, J. (1967). Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochemical and Biophysical Research Communications, 28(5), 815–820.
   这篇文献就是SDS-PAGE技术的起源了，Shapiro等研究了十几种蛋白质在SDS-PAGE中的迁移距离，发现迁移率与分子量对数存在线性关系。
   [3] Pitt-Rivers R, Impiombato F S A. The binding of sodium dodecyl sulphate to various proteins[J]. Biochemical Journal, 1968, 109(5): 825-830.
   研究了不同类型蛋白质与SDS结合的数量比例关系。
   [4] Reynolds J A, Tanford C. The gross conformation of protein-sodium dodecyl sulfate complexes[J]. Journal of Biological Chemistry, 1970, 245(19): 5161-5165.
   研究了蛋白质-SDS的构象及其流体动力学性质，给出了迁移速率与分子量线性关系的物理学解释。
   [5] Mattice W L, Riser J M, Clark D S. Conformational properties of the complexes formed by proteins and sodium dodecyl sulfate[J]. Biochemistry, 1976, 15(19): 4264-4272.
   主要从二级结构上解析SDS-PAGE复合物构象，比较了不同复合物模型，提出新的模型解释SDS-PAGE中部分碱性蛋白表观分子量偏低的原因。
     SDS-PAGE是从上世纪60年代初发展起来的一种蛋白质鉴定技术，当时主要用于病毒蛋白、糖体蛋白和血清蛋白的研究[1]。1967年，Shapiro等[2]将该技术应用于蛋白质分子量分析，此后这种方法逐渐普遍起来。在研究中，Shapiro等先用1%的SDS处理蛋白质，再通过透析置换到0.1%SDS的磷酸缓冲液中，最后在0.1%SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳，经考马斯亮蓝染色得到蛋白质的迁移结果，他们发现蛋白质的迁移速率与分子量对数之间存在很好的线性拟合，如下图：
   
   Shapiro, A. L., Viñuela, E., & V. Maizel, J., Biochemical and Biophysical Research Communications, 1967, 28(5), 815–820.
   
     1968年，ROSALIND等[3]等研究发现，在一定pH和盐离子浓度下，SDS结合蛋白质具有比较固定的比例，并且这一比例与蛋白质种类有关：对于部分糖蛋白，1g蛋白质结合0.7~1g SDS；对于不含二硫键的蛋白，1g蛋白质结合1.4g SDS；含有二硫键的蛋白质，1g蛋白质结合0.7~0.9g SDS，二硫键被还原后，1g蛋白结合1.4g SDS。1970年，Reynolds等研究了SDS-蛋白质复合物的结构，分析了“棒状”复合物的流体动力学特征，得出复合物的特征粘度与分量子存在指数关系，可以进一步推导出复合物的斯托克斯半径的对数与分子量对数存在线性关系。这几篇论文基本上奠定了SDS-PAGE的理论基础，感兴趣的同学可以好好看看。

2. 表观分子量大于或小于实际分子量的成因
     在SDS-PAGE上迁移率发生异常，是家常便饭，不论是酸性蛋白还是碱性蛋白，都会因为它们的固有电荷改变了SDS-PAGE的荷质比而偏离正常值。一般认为，酸性蛋白富含负电荷可能迁移较快，碱性蛋白质可能迁移较慢，事实并非如此，比如上图中，RNase A和溶菌酶表观分子量都小于实际分子量，这两个蛋白质都属于碱性蛋白。为什么出现这样的偏差呢？Mattice等[5]在他们的模型中给出了解释：RNase A、组蛋白等碱性蛋白与SDS形成复合物后，仍含有大量紧密的螺旋结构而不是松散的无规则卷曲，紧密的构型使复合物在凝胶中有更小的阻力，因此迁移的更快。这一研究也表明，SDS-蛋白质复合物并非都是无差别的“棒状”结构，这样导致不同蛋白质分子量对数与迁移率有更复杂的关系。
     用SDS-PAGE评估相对分子量是需要严格条件的：1）蛋白质结构、氨基酸构成要接近，ROSALIND等的研究已经证明，不同的蛋白质结合SDS的能力是不同的，使用相同的条件处理不同类型的蛋白质，迁移偏差是必然的；2）蛋白质要处于相同的溶剂环境，有些样品处于高盐溶液，有些处于低盐环境，有时pH也有极大差异，即使经过相同的SDS-PAGE loading buffer处理，蛋白质结合SDS-PAGE的情况也可能有很大差别；3）分子量参照的影响，现在很多蛋白质marker使用预染色marker，有色染料会在一定程度上影响迁移的准确性，如果需要比较准确的估算相对分子量，推荐使用非预染色marker。
     此外蛋白质修饰也会影响迁移率，通常可以见到磷酸化导致蛋白质的迁移减慢，虽然磷酸根增加了蛋白质的负电荷，但多半由于构象变化和电荷排斥导致SDS结合减少，迁移减慢，这种情况一般经过去磷酸化处理后，迁移速率能够恢复。另一种典型的修饰是糖基化修饰，这个影响很大，除了糖基化蛋白质结合SDS的能力下降外，糖基改变了蛋白质斯托克斯半径，迁移速率往往有较大的减慢，如下图：

   
   
   Shaw M L, Stone K L, Colangelo C M, et al. Cellular proteins in influenza virus particles[J]. PLoS pathogens, 2008, 4(6): e1000085.
   
   

   图中lane1 为未经处理的蛋白，lane2为去糖基化的蛋白，糖基化蛋白质的表观分子量显著高于实际，而去糖基化处理后基本上恢复正常。组氨酸标签融合常用于蛋白质的分离纯化，细心的技术人员可能会发现，末端融合组氨酸标签后，表观分子量往往会变大，这主要是正电荷增加导致的。组氨酸融合蛋白质不同于组蛋白，末端的组氨酸一般不会影响蛋白质结构，但末端氨基酸残基对等电点却有很大影响，分析一些等电点计算软件的开源代码，不难发现，蛋白质两端氨基酸在计算等电点时有更高的权重。
     除了上面罗列的这些情况，一些金属离子依赖的酶，在SDS存在时仍有结合金属离子的能力，如钙调蛋白质，有没有Ca2+离子，表观分子量差异极大。因此，在进行蛋白质分析时，如果需要比较准确的分析蛋白质分子量最好选择质谱；要鉴定蛋白时，如果是酶最直接的方法的是活性鉴定，如果是其他蛋白质（抗原、抗体、细胞因子等）可以选择western blot，IP等免疫学方法，SDS-PAGE只能作为一种辅助验证方法，不能作为唯一判断标准。

3. 经过SDS、还原剂、高温处理得到的一定是单亚基吗？

   
   
   Kado Y, Inoue T, Ishikawa K. Structure of hyperthermophilic β-glucosidase from Pyrococcus furiosus[J]. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2011, 67(12): 1473-1479.
   
   

     这是Kado等研究强烈火球菌超嗜热β-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE结果，酶经2% SDS，710 mM β-巯基乙醇，95℃处理20min，蛋白质依然以二聚体形态出现。在常规的还原型SDS-PAGE中，SDS主要破环氢键和疏水作用，β-巯基乙醇还原二硫键，高温破环三维结构也使SDS与蛋白质充分结合，但这并不是必然的。一些多聚体蛋白质，有极强的分子间相互作用（氢键、盐桥、疏水作用），SDS、还原剂、高温处理并不能完全破坏这种作用，无法得到单亚基，所以有时看到电泳结果上出现倍数关系的条带，可能是蛋白质亚基未完全解离所致。对亚基间边界作用分析感兴趣的可以参考《体外分子进化改善β-葡萄糖苷酶酶学特性》一文中第六章的内容。