你想知道的琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳
【原理】兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
【核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液 中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。也就是说 —— DNA上有磷酸根，在一般情況下带负电，所以必然朝正电方向前进】

一、制配胶

按照一下表格进行配胶：（0.8-1 % 的浓度配制，如果链大，则可选 1.2%）

配比大概量

2、称量琼脂糖 g 于锥形瓶中，加入 的TAE电泳缓冲液溶解，用微波炉加热3min（直至液体透明），温度以尽量不烫手背为准，加染料（有毒）

• 1μl：10ml = 染料 ： 溶解液
  【加入过程中注意：琼脂糖粉在微波炉中加热时间不宜过长，每次当溶液起泡沸腾时停止加热，否则会引起溶液过热暴沸，造成琼脂糖凝胶浓度不准，也会损坏微波炉。溶解琼脂糖时，必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清】
  3、摇晃均匀，勿起气泡，缓慢沿着一边倒入，勿起气泡、勿起气泡、勿起气泡。可把梳子拔起再插。
  4、等待大概30分钟 - 1小时左右

二、上样
1、根据你想要的量来进行跑。例如：10μl 样品，4、6μl Mark，用微量移液枪小心加入样品槽中。
【用微量移液枪小心加入样品槽中，每加完一个样品要更换枪头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿】

三、电泳
1、加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在110 V，电流在40 mA以上。横压跑
2、当条带移动到距凝胶前沿约2 cm时（约40 min），停止电泳。
3、打开电脑和观测仪器， 紫外下拍照并观察。
注：PCR产物跑完胶结束后可放到4℃冰箱

备注：
1、凝胶厚度和孔径大小
一般而言， 较厚的凝胶 运行过程中产生热量也较多，可导致条带扩散。 由于凝胶染色的高背景或凝胶染色和/或脱色所需时长(如进行 电泳后染色 )，可能会出现可视化不佳的情况。 对于 琼脂糖 凝胶，厚度以3 - 4 mm为佳，不推荐超过5 mm厚度的凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶 的厚度由制造商提供的用于凝胶灌制的垫片决定，最常见的是0.75 mm,1.0 mm,1.5 mm。
由 胶梳形状决定的 孔径大小，不仅影响样品的装载量，而且会影响条带的分辨率。 虽然较大的孔可容纳更大的样品负载，但同时也会产生粗条带，减少条带分辨率并产生污点。 而长而窄的孔可容纳的样品量虽小，但可提供更清晰的条带，以获得更好的分辨率。 减少高密度样品的进样量可提供更高强度的条带。
2、跑电泳的时间
电泳的时间短，不同长度片段的DNA条带还未分离，都聚集在一起，所以只能看见DNA含量最高的主带；而电泳时间比较长，不同长度片段的DNA条带已经分离，可以清晰看到不同长度片段的DNA条带。
3、跑出的DNA带模糊

• DNA降解：避免核酸酶污染。
• 电泳缓冲液陈旧:电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。
• 所用电泳条件不合适:电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。
• DNA上样量过多：减少凝胶中DNA上样量。
• DNA样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
• 有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。
• DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。