单细胞108篇文献解读之3---A Targetable EGFR-Dependent Tumor-Initiating Program in Breast Cancer

3 、天机星 智多星 吴用

乳腺癌患者中大约有10%~17%的被诊断为TNBC，其具有较高的肿瘤异质性，是乳腺癌分型中治疗效果最差的一类；与其他类型乳腺癌相比，TNBC具有发病年龄更早、肿瘤体积更大、恶性程度更高、复发转移更快等特点。

由于没有相应的激素受体或HER2表达，因此内分泌治疗、抗HER2靶向治疗以及化疗均不能成为TNBC的有效治疗方法，临床上亟需新的治疗方案。随着对TNBC研究的深入开展，其响应靶向治疗敏感性的分子机制不断的日益深入。

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2017年10月底，加拿大的科学家利用Chromium^TM Single Cell 3' Solution针对三阴乳腺癌进行群体单细胞转录组测序，解析吉非替尼治疗三阴乳腺癌的机制，进而为三阴乳腺癌的精准靶向治疗提供新的参考。

下面小编对该文章的思路进行了详细解析~

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乳腺癌靶向EGFR依赖性治疗分子机制研究>>>> 研究背景

不同的三阴乳腺癌（TNBC）患者对针对表皮生长因子（EGFR）的靶向治疗有多种不同的反应。该研究构建了TNBC的PDXs模型，利用群体单细胞测序的方法解析肿瘤的异质性，寻找到EGFR抑制剂吉非替尼作用的细胞亚群，探索不同三阴乳腺癌个体对于吉非替尼治疗敏感性差异的可能原因。
研究思路

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图1. 乳腺癌靶向EGFR依赖性治疗分子机制研究思路

研究方法

利用Chromium^TM Single Cell 3' Solution方法对三阴乳腺癌进行群体单细胞转录组测序（3,483个细胞），解析肿瘤的异质性，寻找到EGFR抑制剂吉非替尼作用的细胞亚群；结合功能验证（PDX模型），探索三阴乳腺癌对于吉非替尼治疗敏感性差异的分子机制。

研究结果

1. 乳腺癌患者PDXs对表皮生长因子（EGFR）抑制的响应模型筛选

为了研究临床相关的乳房肿瘤对EGFR抑制的敏感机制，我们制定了一个主要由TNBC组成的PDX集合。用PDX临床试验的方法，对EGFR抑制剂吉非替尼的敏感性进行队列筛选；异常响应的PDX模型显示肿瘤消退，对特殊反应者的深入研究让我们更清楚的认识了TNBC对用药敏感的机制，并进一步分析，EGFR及其信号通路成员的遗传改变不能解释TNBC对EGFR抑制剂的异常反应（图2）。

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图2. EGFR及其信号通路成员的遗传改变不能解释对EGFR抑制的异常反应

2. 群体单细胞转录组测序鉴定间充质/干细胞样亚群内的EGFR表达差异

采样基因组方法未能确定吉非替尼对EGFR抑制的敏感性机制，在单细胞水平评估EGFR基因的表达；通过免疫荧光（IF）的方法，在原发肿瘤和PDX的恶性细胞中均观察到异源EGFR表达（图3A）。

为了准确的了解与异源EGFR表达相关的各亚群的功能特性，对小鼠PDX模型的新鲜细胞利用Chromium^TM Single Cell 3' Solution进行群体单细胞转录组测序（3,483个细胞，每个细胞平均具有40,564个独特的分子识别标签（UMI）和5,146个基因）。基于t-SNE聚类分析的方法来识别亚群，细胞分成六个亚群（图3B和C）。

对来自前五个主要细胞簇之间的差异基因表达进行了特异性标记 ，找出了间充质/干细胞样亚群中各个细胞亚群的特征，位置，分布，及功能（图3D~J）。

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图3. 群体单细胞转录组测序鉴定间充质/干细胞样亚群内的EGFR表达差异

3. EGFRhi间充质/干细胞亚群具有功能性富集肿瘤的潜力

为了进一步研究各个亚群之间的关系，使用Monocle以非监督的方式沿着分化的轨迹排列细胞。间充质/干细胞亚群分布于末端分支，与位于其他极端的基底和核/线粒体簇相对。从正常乳房上皮细胞分选的基底细胞（BCs）与腔细胞（LCs）中均表达出间充质/干细胞样标志（图4A和B）。

为了鉴定表面EGFR是否具有表达干细胞样/再生性质细胞的能力，使用荧光激活细胞（FACS）分选EGFR^hi和EGFR^lo细胞亚群；EGFR表达增强，其中来自间充质/干细胞特征的基因显示EGFR^lo和EGFR^hi表达最高，其与单细胞测序的特征相同（图4C和D）。

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图4. EGFRhi间充质/干细胞亚群具有功能性富集肿瘤的潜力

4. 多个PDX模型中，EGFR^hi异质性与肿瘤起始活性细胞（TIC）相关联

在独立的吉非替尼作用乳腺肿瘤模型中，验证EGFR是否与TIC相关，使用IF对我们的PDX群组中的EGFR进行评估。使用自动化的单细胞图像分析算法，观察到EGFR表达的不同（图5）。

总之，人类乳腺癌的异质EGFR表达亚型，其与TIC活性和肿瘤的扩增有关，因此使得这类肿瘤亚型对于EGFR的抑制剂治疗更为敏感。

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图5. 多个PDX模型中，EGFR^hi异质性与肿瘤起始活性细胞（TIC）相关联机制研究

研究结论

该研究使用群体单细胞转录组测序的方法解析了三阴乳腺癌群体细胞的异质性，鉴定出对EGFR相应的细胞亚群，并与功能验证相结合，证明使用吉非替尼治疗三阴乳腺癌的作用新机制，为三阴乳腺癌的精准靶向治疗提供新的参考。

参考文献

Savage P, Blanchet-Cohen A,Revil T, et al. A Targetable EGFR-Dependent Tumor-Initiating Program in Breast Cancer[J]. Cell Reports, 2017, 21(5): 1140-1149.
原文链接：单细胞转录组测序引领三阴乳腺癌靶向治疗 走向精准时代