NGS018 微卫星不稳定性

1.微卫星不稳定性（MSI）

• 1.1 微卫星序列
  MS序列，是一些短而重复的DNA序列，串联重复排列，又称短串联重复（short tandem repeat,STR），常见类型为双碱基CA/GA/GT或单碱基A/T等。微卫星序列以1-6bp为一个重复单元，重复次数不超过60次，人类基因组中有数以万计的微卫星位点，这些微卫星位点近似均匀的分布在各个染色体上，所有的微卫星序列约占整个基因组的3%，微卫星序列按照重复序列的结构可分为简单重复（由单一重复单元构成）及复合重复（有重复单元不同的多个重复序列构成），与DNA中的其他区域相比，微卫星区域具有较高的突变率，其高突变率的直接表现是高度的多态性，也即不同的个体之间，或肿瘤组织及正常组织之间，微卫星位点重复单元的重复次数存在差异。
• 1.2 微卫星不稳定性
  微卫星不稳定性（Microsatellite Instability，MSI），是指由于在DNA复制时插入或缺失突变引起的微卫星（Microsatellite, MS）序列长度改变的现象。在DNA的复制过程中，DNA聚合酶在遇到串联重复序列时会发生“打滑”，引起微卫星位点中核苷酸的插入或缺失。而这一过程可以被错配修复（mismatch repair,MMR）系统所识别并修复，若MMR基因发生启动子区的高甲基化或编码区的突变，导致其功能丧失，则会无法及时修复微卫星中自发的高频长度变异，从而引起MSI。当DNA错配修复功能（mismreprinter，MMR）异常时，微卫星的复制错误无法纠正并且连续积累，使微卫星的序列长度或碱基组成发生变化，这称为微卫星不稳定性（MSI），并使基因组表现出高突变表型。在肿瘤中，MMR功能缺陷通常是由MMR基因（MLH1，MSH2，MSH6和PMS2）和相关基因EPCAM的致病性突变引起的，或者可能是由MHL1启动子区域的高甲基化引起的缺乏MLH1的表达导致。MS序列可以位于基因的重要非编码区，也可以位于基因的编码区，多态性分布于整个基因组，个体差异大。
  MSI现象于1993年被Jacobs等人在结直肠癌中首次发现。随着针对MSI的研究深入，发现MSI现象不止存在于结直肠癌，在子宫内膜癌、胃癌、肝细胞癌、乳腺癌等实体瘤中均有发生。

2.MSI检测方法

目前检测癌细胞中的MSI时，既可以通过检测MMR基因缺失来确定是否发生MSI，如依赖于免疫组化技术的蛋白水平检测，也可以直接检测MSI的序列变化，如PCR（聚合酶链反应）检测等的分子水平检测。

2.1 免疫组化方法（Immunohistochemistry, IHC）

常见的方法为采用免疫组织化学方法检测肿瘤组织中错配修复基因MLH1、MSH2、MSH6及PMS2的表达。任何一项错配修复基因表达缺失，被定义为MSI，否则即为微卫星稳定（MSS）。其中一个表达缺失则称为低度微卫星不稳定(MSI-L)，2种或2种以上蛋白表达缺失为高度微卫星不稳定(MSI-H)。此方法检测MSI相对较简单，成本较低。但存在一些问题，如使用抗体的不一致、病理医生的阅片标准不一致等。

2.2 分子水平的检测

• 2.2.1 聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR)技术
  目前主要采用多重荧光PCR结合毛细管电泳的方法。通过PCR方法检测特异的微卫星重复序列扩增判定MSI状态，比较肿瘤患者的标本组织与正常组织的位点突变情况。其比较的位点为美国国家癌症研究所（NCI）推荐的5个微卫星位点：BAT25、BAT26、D5S346、D2S123及D17S250。其中≥2个位点发生改变判定为高度微卫星不稳定（MSI-H），仅1个位点发生改变判定为低度微卫星不稳定（MSI-L），无位点改变判定为微卫星稳定（MSS）。有研究认为，二核苷酸重复序列的特异性和灵敏度比单核苷酸重复序列要低，因此关于最适合MSI检测的位点仍存在争议。Bacher等对266个微卫星位点(其中包括单核苷酸、二核苷酸、四核苷酸以及五核苷酸微卫星位点)检测的敏感性及准确性进行评估，提出了Promega分析系统，该系统使用五个单核苷酸微卫星位点(BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24和MONO-27)及两个五核苷酸微卫星位点(Penta C和Penta D)检测MSI。
  大量的实验证实，MMR免疫组化检测结果与MS的PCR检测结果有高度关联性，灵敏度92%，特异性可达100%。

该方法目前是检测MSI的方法学“金标准”，但操作过程复杂，花费较高，且在结果判断中会碰到以下问题，如荧光的过强或过少、非特异性峰、不显著的峰大小改变，杂合性缺失等。

• 2.2.2 新一代测序方法（Next Generation Sequencing, NGS）
  近年来，随着高通量测序平台的广泛应用，NGS平台目标区域测序（即NGS panel）或全外显子组测序（WES）或全基因组测序（WGS）开始应用于MSI检测，使用计算工具来同时研究基因组上的大量微卫星序列成为可能，已报道的基于NGS平台的MSI算法包括但不
  限于下表：

  
  
  基于NGS的MSI算法
  
  

  纪念斯隆·凯特琳癌症研究中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center，MSK）的一项研究使用NGS方法对12,288例实体瘤病人进行检测，判定MSI状态，并用MSI-PCR/MMR-IHC进行了验证。实验证明, NGS方法较MSI-PCR方法具有更高的敏感性。

MSI检测方法比对

MSI检测方法学比对

3.MSI检测的临床意义

• 3.1 Lynch综合征的筛查
  Lynch综合征，亦称遗传非息肉病性结直肠癌（HNPCC），是一种呈家族遗传倾向的常染色体显性遗传病，由于MMR基因发生胚系突变所致，约占所有结直肠癌（Colorectal carcinoma, CRC）3%～5%。Lynch综合征最突出的特点之一是携带者本人或家族成员可发生CRC及其他多种Lynch相关肿瘤。MSI是Lynch综合征的特征性分子，约90%以上表现出MSI。同时并不是所有的MSI均是Lynch综合征，在散发性CRC中也存在10%～15%的MSI。
• 3.2 MSI与结直肠癌的预后
  临床研究证实，MSI与结直肠癌的预后有着密切的关系。MSI-H结直肠癌患者相比MSS患者具有显著的生存优势，临床表现较差，但预后更好。研究证实，针对Ⅱ/Ⅲ期结直肠癌患者，MSI-H患者的总生存期及无病生存期明显延长。美国国家综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）发布的结直肠癌指南，建议MSI检测应在所有结直肠癌史的病人中进行。
• 3.3 MSI与指导用药
  研究证实，MSI-H的结直肠癌Ⅱ期患者不能在氟尿嘧啶（5-FU）治疗中获益。同时因MSI-H的晚期结直肠癌患者通常具有PD-1及PDL-1等的高表达，可通过对PD-1/PD-L1的靶向抑制，促使机体免疫系统攻击和杀灭肿瘤细胞。目前美国FDA已批准PD-1免疫治疗单抗pembrolizumab、ipilimumab和nivolumab用于具有错配修复缺陷（dMMR）/MSI-H表型的转移性结直肠癌（mCRC）的末线治疗。除了mCRC的治疗外，2017年5月，美国FDA批准了PD-1抗体pembrolizumab用于治疗成人和儿童具有dMMR/MSI-H表型的没有其他治疗选择的，不可切除或转移性实体瘤患者。
  《中国结直肠癌诊疗指南》（2010版）就明确了“Ⅱ期结直肠癌，有条件者建议检测组织标本MMR或MSI，如为dMMR或MSI-H，不推荐氟尿嘧啶类药物的单药辅助化疗”。在《中国结直肠癌诊疗指南》（2017版）的组织病理学检查部分，增加了MMR或MSI的检测作为复发或转移性结直肠癌的推荐检测方法，“确定为复发或转移性结直肠癌时，推荐检测肿瘤组织K-ras及N-ras基因、BRAF基因、错配修复蛋白表达或微卫星状态及其他相关基因状态以指导进一步治疗。”

4.相关检测产品介绍

目前国际上已上市的产品有：

• 4.1 MSI-IVD Kit (FALCO)
  日本FALCO公司的MSI-IVD Kit已获得日本厚生劳动省的批准上市。该试剂盒采用PCR技术检测癌组织中提取的基因组DNA中的MSI状态，检测7个微卫星位点（五个单核苷酸微卫星位点BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24和MONO-27及两个五核苷酸微卫星位点Penta C和Penta D）。该产品由日本FALCO公司与Promega公司合作开发，作为伴随诊断试剂，用于指导PD-1抗体pembrolizumab在局部晚期或转移性癌症患者中的应用。
• 4.2 VENTANA MMR IHC panel
  该产品采用IHC方法检测经福尔马林固定石蜡包埋的结直肠癌组织切片中的四种MMR蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2，及BRAF V600E
  突变蛋白。用于Lynch综合征的辅助诊断，同时检测BRAF V600E突变蛋白用于散发性CRC及Lynch综合征的辅助鉴别诊断。此产品通过De Novo途径在美国上市。
• 4.3 MSK-IMPACTTM
  2017年11月16日，美国FDA批准纪念斯隆·凯特琳癌症研究中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center，简称MSK）基于二代测序技术的癌症基因检测分析平台MSK-IMPACTTM。该产品能够一次对病人肿瘤468个基因的突变进行检测，并且可以检测MSI基因组特征。该产品仅限于在MSK中进行使用，其检测结果不与任何药物联用。该产品的MSI的检测性能通过对10,900名患有66种不同类型晚期实体瘤患者的研究进行确定。
• 4.4 FoundationOne CDx (F1CDx)
  2017年11月30日，美国FDA批准了Foundation Medicine公司针对多种实体瘤的二代测序的体外检测产品—FoundationOne CDx（F1CDx）。该产品仅允许在Foundation Medicine公司进行检测。这款产品除了可检测5种肿瘤中的324个基因的突变，还可以检测MSI和肿瘤突变负荷（TMB）两个基因组特征，是FDA批准的首款获得突破性认定的癌症NGS体外诊断检测产品。