illumina测序原理

hello，大家在疫情期间都是怎样度过的呢？今天我利用一点时间，我们回顾illimina测序原理，非常值得从事生物学研究生的小白查阅哦~ 我的主要参考资料是如下的两个非常重要的vedio以及推文，链接如下。

---

学习资源：

vedio：http://www.iqiyi.com/w_19rsd3nydd.html
推文：https://www.jianshu.com/p/e6527ce46b0c?utm_campaign=maleskine&utm_content=note&utm_medium=seo_notes&utm_source=recommendation

---

开始之前，先来了解几个专有名词：

• index
  一般情况下，利用illumina进行测序时，我们会用多个样本进行测序分析。所以，这里就涉及到了index,

对文库中的接头进行标记，每一个样本中含有特定的接头，每个街头中含有特定的序列，这段特定的序列就是index,也成为Barcode，即

• Flowcell

  
  
  图片参考如上推文链接

对flow的说明：

一个flowcell含有8条通道（8*lanes），每一条lane内表面含有化学修饰，其化学修饰主要为两种DNA引物（该两种引物与DNA文库的接头序列互补），lane上面的两种DNA引物是通过共价键连接到flowcell上面的。正因为flowcell上面存在着共价键，当有液体通过flowcell上时，与共价键相连的DNA才不会因液体流动而冲掉。

• DNA library

专有解释：
通过初试的学习，你已经了解到了什么是DNA文库，简单来说DNA文库就是许多的DNA片段，在两头接上了特定的DNA接头形成的DNA混合物。
文库特点：
①其中间部分插入的序列是各种各样的
②其两边的接头序列是已知的且为人工特异性加上

图示构建library的大致过程：

用超声波将DNA片段打碎

↓

Klenow酶在3‘端加A碱基

↓

用DNA连接酶将其连接完整，DNA文库构建完毕，即’library‘

• 桥式PCR

桥式PCR过程：

①首先把文库加入芯片中（flowcell)
注意：因为文库中的两端接头与芯片中的两个引物是互补的，所以此刻会产生互补杂交

文库接头与芯片引物的相认

②把dNTP和DNA聚合酶加入到反应体系中，dNTP会沿着flowcell中的引物继续合成DNA链

新合成的DNA链

③NaOH溶液加入到反应体系中，此时新合成的DNA链即由于flowcell中共价键作用而固定在flowcell上，那么使得文库接头中的DNA链被洗脱下去

文库说byebye,芯片说hello

④加入中和液，使得中和NaOH溶液；从而，芯片新合成的DNA会识别flowcell第二种引物

芯片识别第二种引物

⑤加入dNTP溶液以及DNA聚合酶，继续新合成DNA

新合成DNA链

⑥加入碱溶液，将芯片上合成的DNA链解开

image.png

⑦加入中和液，DNA会和新的引物杂交→加入酶和dNTP,cycle~

DNA与新的引物杂交

↓

不断循环该过程，则得到很多的DNA

---

测序部分：

在进入到测序环节之前，我们需要构建一个中间序列未知两端的接头序列是已知的DNA文库，然后将DNA文库加入到flowcell中进行桥式PCR扩增。通过桥式PCR的扩增，在flowcell中我们将会得到所有的文库中的未知中间序列且数量很多。完成以上过程后，将进行测序环节：
①首先，将桥式PCR扩增的DNA通过化学反应处理使得将其中一条DNA链上的引物中的特定位置发生断裂

②用NaOH洗芯片，最后留下了在flowcell中连接有共价键的DNA链

image.png

image.png

image.png

③开始测序：

首先，加入非常重要的两个物质：
1、带有荧光标记的dNTP（注意其3'端是被叠氮基堵住的，所以一个cycle只能延长一个碱基）

image.png

2、加入聚合酶，聚合酶将会选择哪一种dNTP是与芯片上的DNA链互补的，那么通过聚合酶作用将完成芯片上的DNA碱基与dNTP互补完成。

image.png

3、因为dNTP的3'端是叠氮基堵住的，所以当完成一个碱基识别之后就会停留在此处。用水等将其余的无用无互补碱基洗掉。此时，我们用显微镜以及激光作用进行扫描后，根据红黄蓝绿荧光颜色就会发现该部位对应的碱基是什么，倒回去推理就可以发现新合成的DNA链的碱基是什么→推理模板的碱基是什么

image.png

image.png

4、加入一些化学物质，使得3'端叠氮基堵住的部位与旁边的荧光基团切断，此时3'端羟基宝暴露，再加入新的dNTP以及酶，从而继续读取 ，cycle~

image.png

读取index

①加入碱溶液，使其刚刚测序完成的read1分离出去

image.png

②加入read2，dNTP,酶进行第二轮的测序

image.png

注意：read2是加在index附近的，加入dNTP以及酶之后，继续读取6-8个碱基即可发现index是的序列，从而知晓是哪一个样品。

---

双端测序（PE）

①合成DNA链

image.png

②用化学试剂在模板链上的DNA链的根部进行切割，并将切下的模板DNA链分离出去

image.png

③加上read2，read3进行测序，其测序过程和前面介绍的单端测序过程相同。

注意：这里我们进行一个点一个点的测序，那么一般用cluster来形容这个测序点