转录组 RNA-seq

课堂笔记

RNA-Seq

• 标准测序
  6G数据， 6X1024X1024X1024 位（个碱基）
  →虽然会有波动，会受一些随机误差影响，但是reads数很多，coverage很高，表达量的测量很准

• overview：
  1. RNA-Seq
     ① RNA →mRNA → 反转录为DNA
     ② 打断为fragments
     ③ 加上adapter
     ④ pcr扩增
     ⑤ 建库（双链，两条链+ - 都有）
     ⑥ 基因测序（双端vs单端测序）
     illumina 双端测序，一端测正链，一端测负链
  2. mapping 到基因组上
     ① De novo assembly: reads 能overlap的，拼起来就行
     ② annotation based
     ③ genome guided assemly
  3. 计总reads数
  4. 统计：差异表达分析
  5. system biology

• 基因组测序更关注序列
  RNA-Seq更关注 有多少reads map到了参考基因组，即关注表达量

• junction reads (2%-3%)
  会体现内含子没表达导致的reads空缺，即还能体现剪切方式

• poly A end reads( poly A加尾
  RNA上才有，加尾酶加上的，在mapping时会导致错配

PolyA 与 rRNA

rRNA 占90%,rRNA没有poly A尾巴

法1. poly A selection

• 用oligo-dT磁珠将A提出来，去得很干净， 可以衡量RNA降解
• 3' Bias：如果RNA发生降解，3’端测到的表达量多，5’端少
• 但不能去掉无polyA的RNA和 pre-mRNA

法2. 最后通过探针把rRNA去掉

• 因为有时候要看别的RNA，通过沉降等方法，去掉核糖体，会留下游离核糖体，且有些RNA不在核糖体里，会留下约30%rRNA
• 在基因组上，rRNA的基因有很多，能mapping到很多地方，要丢掉这些reads

stranded vs non-stranded

• 基因组上 很多基因是3’尾巴对3'尾巴
• RNA在基因组上有方向5’→3’，当3'端基因重合，将无法确定reads是源于哪个基因
• stranded：只测固定方向的reads，将read1反向互补，确定RNA方向，确定其来自DNA正链还是负链
• 基因表示图： 从细到粗——内含子，非编码区，编码区，| 起始子

PCR duplication

• 做RNA-seq 表达量分析时 去掉PCR重复
• 找突变，如果duplication很多，会让软件以为该处真的有突变（表达量很高的时候要注意，不要误杀）

fastqc software

quality control

• ASCII-33 表示quality score ：0-255
  节约磁盘空间，质量得分（可能占用两个字符）按一定规则（Phred+33或Phred+64）被转换为单个字符表示。
• MAPQ = -10lgP碱基错误率
• pred scale碱基错误率= 10^^（-score/10）
• adapter content:
  有时候会测到接头adapter上去，导致mapping不到基因组，mapping率很低
  有的软件能去掉adapter，得到不等长的fragment reads，如果软件只能等长，就选取能接受的长度（选择adapter的量和reads长度可接受的长度，权衡）

Hisat2

能够将junction reads mapping到基因组上

uniquely mapped reads

• 做表达量分析的时候，只留唯一mapping的reads即可（有的基因有同源基因，有的有拷贝，或有重复序列）
• unmapped reads 比如环状RNA，或有编辑过的RNA，基因融合了的，突变了的，是否重要取决于研究目的，要挖掘信息！

output of mapping

Sam or Bam（二进制） 格式
一行一个read，每行11列
sam格式讲解：https://www.jianshu.com/p/386f520e5de1
sam flag explain：https://broadinstitute.github.io/picard/explain-flags.html

sam flag explain

如上图，可看出 有意义基因为负链上的基因

sam flag explain：不是很好，quality会很低

• cigar：会告诉我们是否是junction reads
  如 ‘6M237N44M’： 6个连续mapping，237个跳过，44个连续mapping

• samtools： linux专门读取bam或sam的软件
  samtools -q xx -f xx
  可以view，filter，sort，index, merge ,rmoce PCR duplication, Tview, SNP calling

数据可视化

• UCSC genome browser：把自己的track放在云端，给UCSC一个链接就能和UCSC的数据结合起来看
• IGV tool:本地看

基因表达量测定:看表达出多少转录本

长的RNA打断出来的reads多，因此要有衡量标准

• RPKM：看有多少测序出的reads，reads per kilobase per million reads mapped，理论上只与表达量有关，表达量与基因长度、测序深度无关
• FPKM：RPKM算法优化 fragments per million reads mapped ，fragments = cDNA insert
• TPM: Transcript per million 看有多少转录本,RSEM软件汇报
  详细讲解：https://www.jianshu.com/p/1940c5954c81

差异表达基因

• cutdiff: 分析GTF文件
• EdgeR : 较流行较好，
  FC 差异倍数
  CPM平均表达量：表达量多，次数多 即概率里counts多
  红 差异显著
  黑 不显著

splicing analysis

看junction reads的拼接方式，可以定量剪切方式，counts数很重要！
软件 rMATs

• splicing factors
  谁让剪切方式产生差异的

• CLIP-seq
  ChIP-Seq：https://zhuanlan.zhihu.com/p/295399497
  CLIP、RIP-seq：https://www.jianshu.com/p/fff90b2e8f2d

RNA编辑

！！ 一点点错配都有可能出现大问题！ 软件算法不完善等都可能出大问题！用的时候要搞清楚原理，否则很容易出问题

samtools → IGV 可视化

conda install samtools=1.9
conda的samtools版本太低，用的时候会报错，装的时候指定好版本号
samtools view -q 30 -f 64 xx.bam |more
txt结果 用excel 打开 open 可以把IJC_SAMPLE_1， SJC_SAMPLE_1, IJC-SAMPLE_2 ,SJC_SAMPLE_2改为字符串类型