2022-07-24

Sci Adv | Cas9/Nickase通过同源染色体模板修复诱导治疗遗传病

原创 图灵基因 图灵基因 2022-07-24 11:04 发表于江苏

收录于合集#前沿分子生物学机制

在果蝇中开发的一种新的基因组编辑系统，使用来自同源染色体的完整序列对双链断裂（DSB）和单链断裂（SSB）进行有效的体细胞修复。作者将使用nickase的过程称为同源染色体模板修复（HTR）。

体细胞中DSB的修复，通常通过易出错的非同源末端连接来完成。nickase引起的修复表型（与Cas9相比）通过发育时间（分别为晚期和早期阶段）和不期望的诱变事件（罕见和频繁）的产生来区分。

作者指出，nickase介导的HTR代表了“一种有效且意想不到的等位基因校正机制，在基因编辑领域具有深远的潜在应用。”

这项工作发表在《Science Advances》上的一篇题为“Cas9/Nickase-induced allelic conversion by homologous chromosome-templated repair in Drosophila somatic cells”的文章中。

在许多情况下，患有遗传性疾病的患者在两个基因拷贝中携带不同的突变。因此，一条染色体上的突变将在另一条染色体上具有功能序列。研究人员使用CRISPR基因编辑工具来利用这一事实。

加州大学圣克鲁兹分校Ethan Bier实验室的项目科学家Annabel Guichard博士说：“在切割突变DNA后，细胞的修复机制可以使用健康的变体来纠正缺陷突变。值得注意的是，这可以通过一个简单无害的切口更有效地实现。”

研究人员使用眼睛颜色突变体来可视化同源染色体模板修复（HTR）。这种突变体最初的特征是完全是白色的眼睛。但是，当同样的果蝇表达引导RNA外加Cas9时，它们的眼睛上会出现大的红色斑点，这表明细胞的DNA修复机制已经成功地利用来自另一条染色体的功能性DNA逆转了突变。

然后，他们用切割一条DNA链而不是两条DNA的nickases测试了他们的新系统。Nicks还引起了红眼颜色的高水平恢复，几乎可与野生型苍蝇相提并论。他们发现，HTR介导的白色位点等位基因转换对由Cas9衍生的Nickas D10A或H840A诱导的SSB的反应（40–65%）比对由完全活性Cas9诱导的DSB（20–30%）更有效。

加州大学圣地亚哥分校Bier实验室的博士后Sitara Roy博士说：“我简直不敢相信nickase的效果，这完全出乎意料。”研究人员指出，新系统的多功能性可以作为修复哺乳动物基因突变的模型。

“我们还不知道这个过程将如何转化为人类细胞，以及我们是否可以将其应用于任何基因。”Guichard说，“可能需要进行一些调整才能获得有效的HTR，以应对人类染色体携带的致病突变。”

这项新研究利用“等位基因驱动”扩展了该小组先前在精确编辑方面的成就，该等位基因驱动利用引导RNA扩展了基因驱动的原理，引导CRISPR系统切割不想要的基因变体，并用该基因的首选版本替换它们。

该团队研究的一个关键特征是，与传统的基于Cas9的CRISPR编辑相比，他们基于nickase的系统导致的靶向和非靶向突变要少得多。他们还指出，在几天内缓慢、连续地交付nickase组件可能比一次性交付更有益。

“这种方法的另一个显著优势是它的简单性。”加州大学圣地亚哥分校细胞与发育生物学系教授Ethan Bier博士说，“它依赖的成分很少，而且DNA缺口是‘软的’，这与Cas9不同，Cas9会产生完整的DNA断裂，通常伴随着突变。”

“如果可以通过促进同源物配对或优化nick特异性修复过程来增加此类事件的频率。”Roy指出，“则可以利用此类策略来纠正许多显性或交叉杂合致病突变。”