0047-【宏基因组】-qiime2官方教程实践2-Microbiota Transfer Therapy

1. 数据来源文章

文章名称：
Microbiota Transfer Therapy alters gut ecosystem and improves gastrointestinal and autism symptoms: an open-label study
文章链接：
https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-016-0225-7#Sec1

文库类型：16S V4
测序平台：MiSeq PE300

研究方法;
本实验研究自闭症且胃肠道功能紊乱患者，采用粪便菌群移植方法，来降低患者的行为异常和肠道紊乱。监测移植后18个月范围内肠道菌群的变化。

数据下载链接：
http://datacommons.cyverse.org/browse/iplant/home/shared/iVirus/ABOR?page=0

软件版本：qiime2-2018.4

2. 数据准备

source activate qiime2-2018.4
# 创建文件夹
mkdir qiime2-fmt-tutorial
cd qiime2-fmt-tutorial

# 实验设计表
wget http://bailab.genetics.ac.cn/markdown/QIIME2/sample-metadata.tsv

# 下载原数据的1%
wget -O "fmt-tutorial-demux-2.qza" "https://data.qiime2.org/2018.4/tutorials/fmt/fmt-tutorial-demux-2-10p.qza"
wget -O "fmt-tutorial-demux-1.qza" "https://data.qiime2.org/2018.4/tutorials/fmt/fmt-tutorial-demux-1-1p.qza"

3. 质量控制——Sequence quality control

# 序列质量评估
qiime demux summarize \
  --i-data fmt-tutorial-demux-1.qza \   --o-visualization demux-summary-1.qzv qiime demux summarize \
  --i-data fmt-tutorial-demux-2.qza \   --o-visualization demux-summary-2.qzv 
# 查看质量评估结果，用于确定下步质控的参数
qiime tools view demux-summary-1.qzv
qiime tools view demux-summary-2.qzv

read1

read2

3. Feature表和代表性序列生成

序列上游13 bp的序列质量偏低，设置trim-left 13截掉前13bp序列；整体150bp的质量都不错，则保留150 bp的序列长度。

qiime dada2 denoise-single \
  --p-trim-left 13 \
  --p-trunc-len 150 \
  --i-demultiplexed-seqs fmt-tutorial-demux-1.qza \
  --o-representative-sequences rep-seqs-1.qza \
  --o-table table-1.qza \
  --o-denoising-stats stats-1.qza
qiime dada2 denoise-single \
  --p-trim-left 13 \
  --p-trunc-len 150 \
  --i-demultiplexed-seqs fmt-tutorial-demux-2.qza \
  --o-representative-sequences rep-seqs-2.qza \
  --o-table table-2.qza \
  --o-denoising-stats stats-2.qza

4. 去噪声数据统计

qiime metadata tabulate \
  --m-input-file stats-1.qza \
  --o-visualization denoising-stats-1.qzv
qiime metadata tabulate \
  --m-input-file stats-2.qza \
  --o-visualization denoising-stats-2.qzv

5. 合并数据——Merging denoised data

# 合并table
qiime feature-table merge \
  --i-tables table-1.qza \   --i-tables table-2.qza \   --o-merged-table table.qza # 合并seq
qiime feature-table merge-seqs \
  --i-data rep-seqs-1.qza \   --i-data rep-seqs-2.qza \   --o-merged-data rep-seqs.qza 
# 可视化
qiime feature-table summarize \
  --i-table table.qza \   --o-visualization table.qzv \   --m-sample-metadata-file sample-metadata.tsv 
qiime feature-table tabulate-seqs \
  --i-data rep-seqs.qza \   --o-visualization rep-seqs.qzv

5. 多样性分析

现在我们已经获得了特征表(Feature/OTU)，以及代表性序列(Feature Seq)
自己尝试用上篇文章的分析方法，回答下面这些问题。

前两节课的知识应该可以回答下面的问题，过两天我也会分析并做出答案。大家一定要实操才有真正分析的能力，想不出来就多操作和思路上一篇分析。

个人微生物组；
按subject-id分类存在组成差异？
按subject-id分类存在丰富度差异？
按subject-id分类存在均匀度差异？
菌群移植；
3. 移植几周后，患者的菌群在unweighted unifrac距离下最像供体；
4. 移植几周后，患者的菌群在bray-curtis距离下最像供体；
5. 比较两种距离结果那种解释更好；
实验设计：比较粪便和试子样品采集方法
4. 比较不同取样方法结果中最大差别的类别？差异类别用blast，或classifier注释有什么不同？
5. 两类样品的unweighted unifrac和bray-curtis间有什么不同？
6. 供体粪便与那种取样的结果更像？
7. 两类取样方法的Alpha多样性存在差别吗？
每个测序Run中有多少样品？在不同测序Run中是否存在系统性差异？

参考文档：
https://forum.qiime2.org/t/qiime2-chinese-manual/838