微生物组16S rRNA数据分析

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微生物组16sRNA 数据分析常规流程：划分OTU ， 构造距离矩阵，分析物种多样性指数，构建序列的进化树及物种注释信息。

可以使用USEARCH、VSearch、Qiime来进行分析。

1、划分OTU

OTU为操作分类单元，基于序列相似度高于97%，将每个sample划分成不同OTU，每个OTU用一条序列read来代表，基于该代表序列进行物种注释和分析。划分完OTU后，可获得OTUtable，包括：每个sample的各OTU所含reads数目，可获得相对丰度信息， 即各OTU中reads所占总sample reads的百分比。

2、物种注释

将各OTU代表序列与生物数据库已有序列进行对比，给每个OTU追溯其物种来源，划分到：界（Kingdom）、门（Phylum）、纲（Class）、目（Order）、科（Family）、属（Genus）、种（Species），进行物种注释。

tips:

根据OTU table和物种注释信息，将相同level的物种丰度相加，整理出每个level的物种丰度文件。比方说将family level中，相同family的物种丰度相加，形成一个family level的物种丰度文件。其作用为可以通过直接比较不同分组的物种丰度，从而找出哪些物种的丰度在组间存在差异，即挑选可以区分不同组的marker（理解：整合相同level的物种，根据物种在不同样本组的丰度不同，从而区分不同的样本组）

3、物种进化树

通过各OTU代表序列之间的相似性来构建物种进化树，aerf多样性用于描述一个样本中有多少个物种,最简单的单位是richness，即样本中OTU的个数。

beta多样性,即距离矩阵用于描述两个样本之间的相似程度

4、物种构成与优势物种

相对丰度最大的物种为优势物种

aerfa多样性分析可采用rarefaction curve稀释曲线, rank abundance curve丰度等级曲线、盒图进行展现。

可参考α diversity分析https://www.jianshu.com/p/7cb452fede5a

rarefaction curve稀释曲线图像解读：横坐标为每次抽样的reads数目，纵坐标表示每次抽样得到的OTU数据。Qiime可以生成稀释曲线。好的抽样方式能够使曲线最终趋于平缓，如图示

rank abundance curve丰度等级曲线图像解读：横坐标为相对丰度从大到小的OTU的ID，纵坐标为相对丰度，如图示

盒图根据各组样本的丰度均值来画图，横轴为物种，纵轴为该物种在所有样本中的平均丰度值

5、各样本α多样性和β多样性指数的组间差异

α多样性

β多样性：以距离矩阵作为输入，使用PERMANOVA做组间的差异比较，以PCA .MDS,ISOMap等进行降维，产生新坐标进行绘图和可视化。

对16s微生物组数据而言，组间物种构成的差异以PERMANOVA的统计检验结果为准，PCA(MDS)所作的二维或三维散点图为可视化手段，为更直观的展现组间差异（需要实践）

6.biomarker

Biomarker是用以区分微生物组的标记，具体的判定准则是：不同微生物组的某相同物种，其相对丰度存在统计学意义上的差异，利用该物种的丰度差异可以区分不同的微生物组别，简而言之，即微生物组中相对丰度明显不同的物种可以作为biomarker。目前常用的方法有：boruta（python或者R可视化）、lefse（web端软件封装）、统计检验方法（heatmap及boxplot展现）

6、功能分析PICRUST

物种功能预测分析linux软件