菌群多样性分析报告

参考链接https://www.docin.com/p-2107733531.html

在开始实验项目之前，明确实验流程，一步一步获取实验结果，以可视化工具展现结果，并加以生物学意义上的分析，获取完整的分析报告。下面给出菌群多样性分析报告中应包含的大致内容，并对实验流程做出指导性的阐述。

1.项目背景与概况

简单阐述所研究项目的国内外现状，本项目的目的与意义。

2.材料与方法（material and methods）

获取材料的方式主要有：现有数据库下载生物序列；测序实验采集；方法，这一部分内容主要阐述实验流程，各个步骤所采用的技术、算法、工具。

2.1原始数据测定实验流程

2.2数据分析流程

利用原始测序数据以及样本的分组信息进行一系列数据分析，流程如下。

（1）序列预处理和质量控制

（2）OTU划分与分类

划分得到样本的OTUs.获取各OTU的代表序列，通过各OTU所包含的reads数目，创建OTU_table;用于分类level鉴定和系统发育学分析。该分析过程可用一些可视化工具进行分析描述.

Q:利用什么方法划分样本的OTU？

各种工具，如：QIIMEE软件调用UCLUST序列比对工具，按照97%的序列相似度进行归并和OTU划分

Q:如何选取OTU代表序列？

每个OTU中丰度最高的序列为该OTU的代表序列

利用已获取的代表序列进行界门纲目科属种的分类，将代表序列和对应数据库的模板序列相比对，获取每个OTU所对应的分类学信息，常用的模板序列数据库有：GreenGenes，RDP，Silva

Q:划分后的OTU丰度不同，丰度极低和丰度极高的OTU出现频率低，丰度极低的OTU非常稀有，相当于菌群数据中的噪音，应该进行去除。

共有OTU通过VENN图来展示。

 

（3.1）样本的Alpha多样性分析

Rarefaction稀疏曲线分析，通过稀疏曲线判定测序深度是否达标。在各样本中随机抽取reads进行OTU划分，OTU数目稳定在一个数值范围内，则表明测序深度达标。

Specaccum物种累积曲线分析，不断增加样本数目，进行OTU划分，OTU数据稳定，则达标；随机抽取不同的固定数目的samples，划分OTU，得到OTU 数目的均值，极大小值，上下边缘，绘制盒图，按照一定规律（递增）改变samples数目，再多次抽样，制作OTU盒图。该图像能描述样本采样的充分性与物种丰富度。

Abundance Range丰度等级曲线分析，将样本按照丰度从大至小排序，展现丰度在样本之间的差异。

多样性指数计算，体现群落丰富度的丰度指数（Chao1和ACE），多样性指数（shannon和simpson）

(3.2)Beta多样性分析

有基于序列的Beta分析（欧氏距离，bray curtis距离等），基于系统进化的Bata分析 （根据系统发生树进行比较）

PCA/PCoA/NMDS排序分析

PCoA与PCA的区别在于PCA是基于原始的物种组成矩阵所做的分析，使用的是欧式距离，仅仅比较的是物种丰度的不同，而PCoA首先根据不同的距离算法计算样品之间的距离，然后对距离矩阵进行处理，使图中点间的距离正好等于原来的差异数据，实现定性数据的定量转换。百分比含义同PCA。

非度量多维标定法(Non-MetricMulti-Dimensional Scaling,NMDS)是一种适用于生态学研究的排序方法，主要是将多维空间的研究对象（样本或变量）简化到低维空间进行定位、分析和归类，同时又保留对象间原始关系的数据分析方法。类似于 PCA 或者 PCoA，通过样本的分布可以看出组间或组内差异。NMDS原设计的目的是为了克服以前排序方法中包括PCA、PCoA在内的缺点，即线性模型。NMDS的模型是非线性的，能更好地反映生态学数据的非线性结构，有的研究认为NMDS的效果优于PCA/PCoA

UPGMA聚类分析

基于以上方法分析得到的距离矩阵，可用UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean)，分析样品间的差异。非加权组平均法，是一种常用的聚类分析方法。其原理是：假定的前条件是在进化过程中，每一世系发生趋异的次数相同，即核苷酸或氨基酸的替换速率是均等且恒定的。通过 UPGMA 法所产生的系统发生树，通过树枝的距离和聚类的远近可以观察样品间相似性

多组UniFrac距离比较

三元相图分析

（3.2.1）菌群比较分析和关键物种筛选

略，随着研究深入再展开

CAP分析

RDA分析

随机森林分析

（3.3）分类组成分析

各分类level（界门纲目科属种）的微生物类群统计

 

各分类level的丰度分析

纵坐标为各个OTU的相对丰度，越长表示相对丰度越高

Metastats组间差异分析

利用Mothur软件，条用Metastats，对门和属水平的分类level在两两样本之间的序列量差异进行比较。

可通过图形进一步呈现各OTU在样本内的丰度分布

LEfSe组间差异分析

基于LDA的方法，目标是筛选关键的Biomarker,提交属水平的相对丰度矩阵到galaxy在线平台，可自动分析，并可视化。

长度越长代表其特征越明显，越适合做样本的biomarker

（3.4）菌群组成交互式可视化

系统发育树构建

GraPhlAN可视化展示

从门到属的所有OTU的等级关系，节点大小表示平均相对丰度

优势物种/OTU热图分析

 

（3.4.1）网络分析

略，随着研究深入再展开