基因表达量计算与差异表达分析常见问题

问 1： 在没有重复实验的情况下，用 RPKM 要怎么做检验呢？
答： 如果要用泊松分布做差异分析模型的话，必须要用 reads count 的。只有 RPKM值的话，可以用 RPKM 的公式反推 reads count 数，再做检验。
问 2： Deseq 是怎么控制 reads 多重比对的？
答： Deseq 只是一个差异分析的软件，多重比对的分配是在 Deseq 之前的。 Deseq 是输入的数据是已经分配好的 reads count，然后用于分析，但是如果 reads 多重比对要怎么处理的，那么要使用 reads 分配分析软件，例如 cufflinks 或 Rsem 软件。 所以Deseq 是不能处理多重比对的，应该之前用软件进行预处理。 一般来说多重比对有两 种方案：
1）如果一个 reads 多重比对的话，可以把多重比对的 reads 删除掉，
2）使用 cufflinks 和 Rsem 分配比对结果 bam 文件；
如果不关心可变剪切的差异，策略 1 也是合理的。如果关心可变剪切，则建议策略 2。
问 3： Deseq、 edgeR 和 cuffdiff 在处理多重比对 reads 的时候差别是什么？
答： Deseq 与 edgeR 只是一个差异分析的软件，就是类似于做方差分析的软件一样。但 cufflinks 是个软件包，从数据比对到 reads count 到差异分析都全包了，所以如何处理多重比对的 reads 是与 Deseq 或者 edgeR 是无关的。 可以用 cufflinks 或者RSEM 来做多重比对的处理，然后做差异分析，则可以继续选用 Cuffdiff 、 Deseq 或edgeR。
问 4： 用 TMM 标准化之后再用基于泊松分布的差异分析算法，计算差异基因靠谱吗？

答：TMM 标准化的确是独立的方法。 既然有生物学重复就不建议用泊松分布模型。 因为 TMM 是 edgeR 的归一化算法，建议后续的差异分析继续使用 edgeR。 泊松分布可以做差异分析，但是这个方法无法估算生物样本之间的个体差异。所以他最后是相当于低估了 P 值，统计结果是存在较大假阳性。

问 5：如果想比较环境对基因表达的差异，分别从两个地区各取三株样品，比较组间差异可以吗？

答： 可以。这个方法是可行的，但是有一点，目前我认为 RNA-seq 最大问题是如果只测三个生物学重复，对模式生物来说还是 OK 的，比如小鼠、 拟南芥，他们个体差异
很小。 我们知道个体差异本来就是组内差异的一部分。所以对于模式生物来说一开始个体差异是非常小的。但是如果从两个区域取样的话，而且非模式生物学样本，例如林木、昆虫，可能个体差异会比较大，容易得到组间差异不显著的结论。 所以想得到一些更稳定的指标的话，建议用混样作为生物学重复来做差异比较将会更加稳定。用混样作为样本的逻辑是这样的， 比如在某个区域取到 30 个样本，然后把每 10 个样本混成一个池，比如前十个，中间十个，后面十个，构成三个样本池，这个时候其实这三个样本池还是不一样的。生物学重复本身就是假设是抽样， 从一个大样本中抽样，来计算抽样误差多大，如果将个体作为重复的话，这种个体差异比较大， 这样就导致抽样误差比较大。但是如果以群体作为样本的话，因为群体的均值更加稳定，得到样本间差异将更小，所以我们才会建议所有样本混合成若干池，这样减少抽样误差。

问 6：cuffdiff 的 bug 主要表现在哪里？
答：因为我们之前做过很多项目，发现 cuffdiff 这个软件估算 reads 数非常诡异。 例
如我们之前遇到过 cufflinks 软件估算到的 count 数突然间一个基因丰度很低的，会
估算得到一个 4 位数的结果；或者说有些基因明明差异不显著的， 会最后得出一个非
常显著的 pvalue。 我们并不了解这个软件的源代码，只是发现这个软件潜在的一些
bug，所以后面我们就把这个软件放弃了不使用了，但是不知道新版本的有没有纠正
这个 bug。
问 7： cufflinks 的问题和 bug 是实践出真知 or 有文献考证？
答：这个 bug 是我们做项目发现的。
问 8：miRNA 表达量是比较低的，是不是现在没有生物学重复，这个差异基因的检出
期望值会减少？
答：其实 miRNA 表达量不低，实际上表达量是相当高。一般来说，miRNA 表达量有
几个特点，首先变异很大，现在在样本内那些高丰度的 miRNA 与低丰度的 miRNA 差
异非常大，可能相差几万倍甚至几十万倍；另外个体间的 miRNA 丰度也是变异非常
大的。所以做 miRNA 测序，往往可能得到的 P 值相对于转录组测序没那么显著的。
有几种解决方案：
1）通过生物学重复样本的数量来提高 P 值，因为个体差异大，理论上增加生物学重复
样本的数量可以减少干扰。
2）可以考虑将多个个体混合池作为样本，减少差异
3）如果说经费有限，不想设重复，就只有对照组与处理组比较，这样用泊松分布也可
能做差异分析模型的，但是这样得到的结果无法证明差异得到的 miRNA 是处理导致
的差异还是随机误差导致的差异，所以这样筛到的 miRNA 还是需要实时荧光定量的
方法，单个样本进行验证来证明在处理组之间是存在差异的。
问 9：用唯一比对的 reads 计算表达量更准确吗？
答：这个基于我们实际观察到的。 理论上 cufflinks 或者 Rsem 软件模型是用最大似然
法对 reads 进行分配。我们在实际项目中发现，用最大似然来做分配之后，最后跟平
均分配几乎是等效的。
比如一个基因存在可变剪切，不同的可变剪切理论上表达量是不同的，所以 reads 平
均分配到各个可变剪切是不同的，用 Rsem 或者 cufflinks 这种软件几乎近似于做平均
分配的，就是说这两个软件在数学模型上几乎完美，但实际应用的时候几乎跟平均分
配是效果相似。 如此推断基因表达量是非常不合理的。而我们用 unique map 的话，
将多重比对的 reads 放弃，这样就只基于每一个转录本唯一的部分计算表达量，我们
发现这样的结果往往更加合理。
如果我们用 unique map 来计算可变剪切表达量可能比较困难，因为可变剪切间的重
叠区域太大。 但是这个策略用于计算基因间的表达差异往往更加合理。毕竟不同的基
因哪怕是基因家族完全相似的部分也是非常少的。如果用 unique map 来计算基因表
达量其实还是相当可靠的，我们通过一些实际项目也支持这点。 在一些项目我们即用
了 Rsem 来计算表达量，又用了 unique map 来计算表达量，最后发现在人里面的样
品算基因家族的时候，发现用 unique 来计算表达量，跟荧光定量结果更加吻合。
而 Rsem 更倾向于做平均分配，这样存在一个问题，有些基因风度非常高，但因为在
Rsem 软件用到的一个类似平均分配的方法，把一些高度的 reads 分配到低丰度的基
因家族里面，这样导致表达量被稀释了，可能最后结果是有问题的。 所以实际中我们
发现唯一比对还是比较理想的。

问 10：怎么处理表达量低的基因？现在有没有统一的标准呢？比如说 RPKM 或者
counts 为多少的时候可以忽略不计或者近似看成某个值？
答：表达量低的基因目前没有标准，一般文献认为 RPKM 值小于 1 或者小于 4 或者
这个基因的 reads 数量小于 1 或者小于 3 就认为是不表达的。一般情况下，一个基因
的表达量极低比如 RPKM 值为小于 1，这个基因就被认为低丰度，至少是没有太大生
物学意义。
当然如果处理组或者对照组，两组 RPKM 值都小于 1，那么这个基因丰度如此低，那
么他是没有多大生物学意义的，所以对后续分析与讨论这样的基因可以忽略不计。我
们认为这些基因完全可以在结果里剔除。
问 11：没有生物学重复，用 DEGseq 算之前需要均一化吗？
答：理论上用 Deseq 或者 edgeR 的话，其实不需要做均一化的，只要将 reads count
作为输入，软件会自动做相应的处理。我们说的均一化是说我们需要了解方法与过程，
均一化是软件自动完成的。
问 12： 看基因表达量是看 cuffdiff 结果中的 value 值还是看 cufflinks 结果中的 FPKM
问 13：如果三次重复的话，基因表达量就算三个 cullinks 结果 FPKM 的平均值吗？
答：是的。
问 14：3 个生物重复样品是分别建库测序得到 3 个数据好，还是将 3 个重复样品混合
在一起，建一个文库测序，得到一个数据好？
答：当然是单独建库，分别做差异分析这样是最好的。如果混样测序了，就没有办法
计算组内差异了，那么审稿人就会质疑这个实验没有重复。
问 15：cuffdiff 将两个样本各三个学重复输入进去出来之后只剩两个样本的 geneexp.diff 的差异基因 30000 多个，但是（significant）这一栏有意义为 YES 只有 600
多个，正常吗？
答：这个正常，gene-exp.diff 这个结果是将所有差异结果都输出了，包括显著与不显
著结果。但 significant 那一栏输出的是预先设定的一个差异倍数或 P 值，所以这个是
正常的。
问 16：现在还有用 degseq 软件算没有生物学重复的吗？
答：没有重复也是可以计算的。但有重复的时候，组内的变异系数软件可以自动算出
来。 如果没有重复，可以人为设定组内变异