关于肿瘤突变负荷（TMB）与panel设计--part1

背景

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       随着2017年底MSK和FMI的两个大panel分别获得FDA批准；2018年国外——百时美施贵宝的欧狄沃（CFDA：非小细胞肺癌）、的科瑞达（CFDA：黑色素瘤和ALK阴性的非鳞状非小细胞肺癌）国内——君实的特瑞普利单抗(CFDA:黑色素瘤)、信达的信迪利单抗（CFDA: 霍奇金淋巴瘤）以及恒瑞5月份刚获批的卡瑞丽珠单抗（CFDA：霍奇金淋巴瘤）先后上市（图1A,图1B）。 同时鉴于PD-1/PD-L1抗体只对每一种癌症的一部分病人有效果（例如在肺癌中仅对大约30%的肺癌患者起效）。肿瘤突变负荷（TMB）作为PD-L1表达、MSI/dMMR 等之外的PD-1/PD-L1药物疗效的标志物之一必然会受到进一步的重视。

        目前不少基因检测公司直接将MSK和FMI两家产品的基因取并集后再做简单的增添，推出500多个基因的大panel产品用来检测TMB。但同时市面上一些先行者则在已有的400-500个gene的panel产品上直接升级到800-1100个基因的panel。最后市面上各家公司的大panel都宣称适用于泛实体瘤的TMB评估，这个“泛实体瘤”的癌种范围到底有多“泛”也值得推敲。接下来在该转化医学专题中分两篇文章尝试对TMB与panel设计进行分析，本篇着重回答以下3个TMB相关问题，下一篇着重分析panel设计：

         Question1:  不同数量级别的panel在不同癌种上的TMB与WES金标准的相关性差异以及指定TMB区间内不同panel的TMB波动情况又是怎么样？

         Question2:  大panel是否在各个癌种上与WES数据TMB相关性都比小的panel高？

         Question3: 市面上从WES 的2,1000多个gene中抽取 1/40~1/20做出来的500-1000 gene 的各种panel，其TMB在“泛”癌种上都能代替WES测序？

图1A. 来源于 网络：药品临床试验登记与信息公示平台上显示的PD-1单抗临床试验情况  

图1B. 来源于 网络： 截至2018年8月，O药和K药在FDA和CFDA获批的适应症    

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a. 数据来源：2018年TCGA数据挖掘文献和2015年肿瘤纯度分析综述文献;

b. TMB计算方法： CCDS区域的突变频率在5%以上的插入/缺失、错义和无义突变（本次不采用FMI的去除热点突变同时引入同义突变的TMB计算方法）；

c. 模拟panel基因数目梯度设计：S1: ~580 genes(MSK+FMI+其它),S2: ~670 genes (580+90);S3: 707genes (580+127); S4:~800 genes (580+90+127)；S5： WES: 21,000 genes；

d. 外显子区域： WES:下载current.CCDS.txt，提取exon区间后liftover转换为hg19版本, panel：以gene为的单位提取（严格来讲应根据染色体位置来匹配，本次偷懒，暂时不考虑约3%的一基因多名称的干扰）。

一. 不同大小梯度的panel TMB与WES TMB在各癌种上的相关性分析

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1.1 TMB数据分布特征分析

     指定癌种病人TMB理论上整体偏低，数据不呈正态分布特征，Q-Q图和Shapiro-Wilk正态分布检验也支持以上推断，因此后续相关分析结果以spearman为准，同时列出pearson相关系数以作比较。

图2. TMB数据分布特征分析：Shapiro-Wilk normality test p-value < 0.05（ 此处只列出一例做演示）

1.2 四个不同梯度 panel TMB与WES TMB 在32个癌种上的相关性分析

固定TMB计算方法和输入数据，实际变量为panel大小，分析不同大小panel在不同癌种上的TMB与WES的相关性。

图3：32个癌种模拟panel和WES数据的TMB相关分析比较（spearman和pearson）

在葡萄膜黑色素瘤（UVM）、胰腺癌(PAAD)、直肠腺癌(READ)等癌种上pearson相关系数比spearman相关系数高了不止一点点，由于pearson相关对异常值敏感，猜测本次分析的这些癌种TMB存在异常值。分析原始数据，不管是用x±3S，还是其它方法，确实存在TMB异常高的个体，参考异常值处理中的四分位距替换法，以上三个癌种处理异常值后的pearson相关系数大幅下降，而对spearman相关影响不大。推测其它癌种效果相似，总之实际问题中如果想省去数据分布特征及异常值情况评估这一步，应直接使用spearman相关。

50%的癌种（16/32）上panel TMB与WES TMB的spearman相关性低于0.65，只是在常见的肺鳞癌、肺腺癌、皮肤黑色素瘤、结肠癌等癌种上有较好的spearman相关性（注意弥漫性大B淋巴细胞瘤本次只有33个数据），市面上各种 panel的TMB可能只适用于部分实体瘤相关的免疫治疗评估；

临床入组前准确的肿瘤诊断分型很重要--例如：葡萄膜黑色素瘤与皮肤黑色素瘤、子宫内膜癌与子宫肉瘤、结肠癌与直肠腺癌等，spearman相关系数相差很大（#准确翻译TCGA上的癌种英文名称也很重要，第一版的翻译就不准，后续图中的癌种中文名以上面表格中的名称为准）；

图4. 四个模拟panel与WES数据TMB的spearman相关情况比较

图5. 四个模拟panel中两个极端组合与WES数据TMB的spearman相关情况比较

    从近600个基因增加到近800个基因后，大部分癌种上panel TMB与WES TMB的spearman相关性是有一定提升的（如上图4），如肾嫌色细胞癌（KICH）上相关性提升了接近10%；但是在一些癌种如弥漫性大B淋巴瘤（DLBC）上，相关性反而降低5%左右（如下图5）。所以本次模拟增加的基因只是提高了弥漫性大B淋巴瘤和胸腺癌以外其它30个癌种 TMB与WES相关性。

图6. 模拟的两个极端panel 与WES TMB相关性比较

图7. 798和579两个极端梯度panel TMB分布QQ图

      798 panel 和 579 panel在32个癌种上TMB相关系数近似正态分布；bartlett.test 方差齐性检验 p-value = 0.7411，显示两组数据离散程度相当，直接采用配对样本T检验做进一步分析：WES和panel TMB spearman相关性均值之差为0.027，!=0，95%置信区间为：（0.017，0.038），p-value = 1.157e-05。将panel从600个gene级别增加到800个级别从32个癌种整体上看确实可以提高其TMB与WES的相关性。

二. 不同梯度panel 在给定10个区间上与WES TMB的比较

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       虽然2019年第一版的非小细胞肺癌NCCN指南中指出如何衡量TMB阈值目前还没有达成共识（图8A），但借鉴CheckMate-227研究中Opdivo（nivolumab）+ Yervoy（ipilimumab）联合疗法一线疗法，对于高TMB（TMB≥10个/Mb，无论PD-L1表达如何）的晚期非小细胞肺癌（NSCLC）达到了无进展生存期（PFS）的结果(图8B)，本次的TMB区间应在10左右上下浮动。

图8A. 2019年第一版的非小细胞肺癌NCCN指南 TMB部分

图8B.   CheckMate-227  ASCO展示

以给定TMB区间的WES样本为准，与落入该区间的样本在各个模拟panel的TMB进行比较，分析不同大小panel在同一批病人上检出TMB的稳定性：

图9A. 10个指定区间内模拟panel TMB稳定性分析 

图9B. 10个指定区间内模拟panel TMB稳定性分析 

       随着基因数目的增加，与WES 数据的TMB相比， panel TMB值分布的四分位图中的离群点、上边缘、下边缘等指标在指定10个区间中的5个区间有较为明显的好转：5.5-6.49，6.5-7.49，8.5-9.49，9.5-10.49，10.5-11.49（也可以对10个TMB区间的四分位距做个Wilcoxon test，但本次划分区间少，同时也反映不出来异常值信息，暂不做定量判断）；

      常规TMB计算方法得到的TMB，panel都要比WES高一截，这其实正常--panel毕竟都是从2,1000多个基因中挑选肿瘤相关基因设计的，本身就带有偏好性，如果接近程度很好就有些奇怪了--用bootstrap的方法从基因全集里面迭代出部分子集应该可以做出好看的结果。

三. 小结

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       a. 不同癌种,影响其TMB的基因集合差异也较大，设计大panel前可以充分利用TCGA相关的开源数据，反复调试迭代，找到既能均衡部分癌种 panel TMB与WES TMB的相关性，又可以使得该 panel TMB在各个指定区间内波动较小的基因集合，简单的将FDA已公布的MSK和FMI的基因取交集是不够的；

       b. panel包含的gene越多，其TMB与WES的相关性越高、稳定性越好的结论实际上是因癌种而异的，例如本次模拟的798panel,其TMB与WES的相关性在弥漫性大B淋巴瘤上的表现反而大幅下降（**注意本次仅使用33个DLBC样本，而信迪利单抗和卡瑞丽珠单抗相关的霍奇金淋巴瘤的WES数据本次未引入）；

       c. 800个gene规模的panel得到的TMB确实会比500-600个基因的panel 稳定一些；

       d.不同的癌种存在不同的TMB cutoff值（如下图8）, 其具体数值必然受该panel设计的gene影响，大而全的panel在计算TMB时似乎可通过取子集的方式保证足够的冗余度（仅限于部分癌种） ;

       e. 如果不谈销售渠道提成，直接上500X的WES可能也是个行的通的办法：一方面PD-1/PD-L1药物的适应症一直在拓展，另一方面与panel相比，毕竟WES测序成本没高多少，而且在近一半的癌种上panel TMB其实并没有较好的反映WES金标准 。

图10.  Nature geneticsA

        但是大panel基因数目的多少往往只是表象——考虑到测序成本，市面上400个gene以上的大panel一般都是以热点突变密度为单位设计，非全外显子设计，这种情况下，实际外显子的区域大小才是影响TMB的根本，非基因数目的多少。

                                                                                                                   写于2019年4月8日

                                                                                                                   补充于2019年5月28日