关于PAGA轨迹分析的一些理解

PAGA（Partition-based graph abstraction）轨迹分析功能包含在Scanpy软件中，是一种基于python的软件，对于没有python使用经验的人来说用起来还是比较吃力的。2019年发表的文献对其工作原理进行了详细阐述，下面是我在做轨迹分析时的一些理解。

在聚类分析中我们寻找的是细胞间的离散属性，也就是细胞之间的不同，而估计分析中我们寻找的是连续属性，也就是细胞之间的相同之处。PAGA是一种基于图形的分析方法，先通过 Louvain algorithm算法对细胞进行降维，生成低纬度的聚类图，基于聚类图进一步分析不同细胞类群之间的关系。下边是我用自己的数据生成的肌细胞谱系的PAGA轨迹分析结果，其实与其说是PAGA轨迹分析图，不如说是PAGA轨迹关系图。

1. 从seurat到PAGA

个人比较习惯R studio的操作环境，所以细胞质控、数据预处理、注释等全部是用Seurat软件分析的（当然scanpy也有同样的功能），将处理后的数据先转为example.h5Seurat，在转为example.5had文件，PAGA可直接分析.h5ad文件.

remotes::install_github("mojaveazure/seurat-disk")  ##安装seuratdisk软件包
library(SeuratDisk)
SaveH5Seurat(example.cell, "example.cell.h5Seurat") ##example.cell直接转为h5Seurat格式保存
Convert("example.cell.h5Seurat", dest = "h5ad")  ##h5Seurat转为h5ad

同样的
#####读取h5ad文件
##h5ad转为h5seurat
Convert('example.cell.h5ad', "h5seurat",overwrite = TRUE,assay = "RNA")
example.cell <- LoadH5Seurat("example.cell.h5seurat")

2. PAGA图

左图是PAGA软件对全部细胞的分群结果，右图是轨迹关系推断（n_neighbors=10；threshold=0.7），可以看到在两张图片中不同细胞类群的位置关系还是比较一致的。轨迹关系结果仅仅只是简单的点-线图，那么如何理解这张图？首先点代表一个细胞类群，两点之间的连线代表两个细胞类群之间有关系，线的长短反映两个细胞类群在聚类图上的位置关系（并没有太重要的作用），线的粗细表示得到的轨迹关系的置信度（可以理解为显著性），线越粗，置信度越高。

 3. 不同参数

做任何分析都会有不同的参数，PAGA轨迹分析也不例外，主要的参数有

resolution， n_pcs，n_neighbors，threshold

resulution, n_pcs两个参数与用seurat分析设置的参数感觉相似，可以设置为相同的值，应该不会对结果造成太大的影响。n_neighbors是计算参数，threshold是结果展示参数（个人理解，可能不太准确）。参数的选择是具有强烈主观性的，分析结果的好坏要看是否符合预期（主观性显著）。下面展示了两个参数不同的分析结果之间的比较。可以看到n_neighbors从5增加到15并不会对结果产生太大的影响。threshold分别设置成0.01，0.03，0.07和0.1，轨迹关系结构发生了显著的变化。从0.01到0.1，轨迹关系判别结果愈发严格，当我们对复杂组织、多种细胞类型的数据进行轨迹分析，可以调高threshold，而简单细胞群体的轨迹判别，可以设置成低的threshol。在这里选择n_neighbors=10，threshold=0.03的结果（主观）。

4. 几个有用的链接/教程

scanpy官网Trajectory inference for hematopoiesis in mouse — Scanpy documentation

文献官网PAGA: graph abstraction reconciles clustering with trajectory inference through a topology preserving map of single cells | Genome Biology | Full Text

两个教程

单细胞转录组之Scanpy - 轨迹推断/拟时序分析 - 简书

轨迹分析_Scanpy进行单细胞分析及发育轨迹推断_颜不良文丑的博客-CSDN博客