【摘要】淋巴细胞活化基因LAG-3是细胞表面抑制性受体，有多种T细胞活化相关的生物作用和细胞因子功能。LAG-3在免疫中起调节作用，是PD-1和CTLA-4之后的又一新发现的抑制性免疫检查点分子，也是下一代肿瘤免疫治疗的潜在靶点。然而，不同于PD-1和CTLA-4，LAG-3的作用机制以及它和其他肿瘤免疫检查点分子的关系尚不明确。LAG-3胞内区域所涉及到的信号通路分子和传统的免疫调节信号通路分子不同，但能发挥相似的免疫抑制效果。
【正文】
LAD-3/CD223最早在体外活化T细胞中被发现。
一、LAG-3的分子特征
（一）LAG-3的功能
1、抑制CD8、CD4T细胞的增殖、活化、功能、扩散和稳态。
2、通过干扰CD4协同受体功能，而非直接作用于CD4，来抑制CD4活化
机制
1、LAG-3可被TCR或细胞因子诱导，在表达细胞因子的活化T细胞表面表达。
2、LAG-3和T细胞膜上的TCR:CD3复合体结合，抑制TCR信号转导，进而终止CD3信号通路诱导的细胞增殖和细胞因子分泌。
3、LAG-3/TCR和配体同时作用，可以抑制TCR:CD3依赖的胞内钙离子流
4、和PD-1相似，LAG-3表达和T细胞耗竭有关，被认为是在肿瘤或慢性病毒感染免疫应答后CD4和CD8T细胞耗竭的标志。
5、LAG-3在TCR聚集后下调TCR依赖的级联信号通路，从而抑制T细胞应答
TCR可以特异性识别APC通过MHC提呈的抗原肽。T细胞和APC之间有多种分子相互促进或相互抑制。
（二）LAG-3的基因和结构域
1990年，Frédéric Triebel博士及其同事就发现了一种与CD4相似的新型淋巴细胞激活基因lag-3。在激活的人T细胞和NK细胞[8]中有一个2 kb的mRNA被选择性转录。lag-3位于人类第12号染色体(12p13.32)短臂的远端，在小鼠第6号染色体。lag-3基因编码498个氨基酸、分子量为70 kDa的I型膜蛋白，成熟蛋白有525个残基，分子量50kDa。其位点与CD4共受体的位点相邻、序列和内含子/外显子和CD4相似，表明lag-3和CD4基因由编码two-IgSF-domain的共同祖先基因进化而来。
CD4和LAG-3的结构分为：胞内区、跨膜区、胞外区。胞外区由D1-D4组成，是四个IgSF结构域( immunoglobulin superfamily-like, 免疫球蛋白超家族)。
D1是Ig类变量区域（V-SET type），在C和C'β链之间有个30个残基的额外的富含脯氨酸的环。和CD4不同，这个环介导了LAG-3和MHC II的相互作用。LAG-3的D2、D3和D4属于C2-SET，CD4的D3属于V-SET。LAG-3的D1-D4有很高的结构性，但是CD4和LAG-3只有不到20%的氨基酸序列同源性。D1和D2之间的β链、D3和D4之间的β链在这些亚结构中刚性延伸。
相比CD4，LAG-3蛋白在D4膜近端结构域和跨膜区之间的连接肽链更长，肽链断裂后使LAG-3以可溶形式释放。这种断裂又两个跨膜金属蛋白酶ADAM10和ADAM17介导，二者的机制不同。ADAM10介导LAG-3的本构性裂解，ADAM17通过PKCθ依赖的TCR通路诱导youdaLAG-3裂解。有证据表明，LAG-3从细胞表面脱落可以促进T细胞增殖和效应功能，是LAG-3调节免疫的又一水平。
LAG-3的胞质尾介导胞内负性信号转导，去除LAG-3会完全阻碍抑制功能。胞质尾包括三个保守模块，（1）可磷酸化丝氨酸S484；（2）KIEELE模块；（3）谷氨酸-脯氨酸二肽多重复序列EP模块。关于这些模块在LAG-3分子功能和下游通路中的作用，存在矛盾的证据。
S484在FxxL模块中已有描述，除了与产生IL-2有关，没有发现其他特定功能。S484可能和CD4中的蛋白激酶C结合位点相似。
KIEELE和一段高度保守的短序列有关，这个序列没有在其他蛋白中发现过，它和LAG-3功能的关系还存在争议。根据Workman的研究，KIEELE缺失可以完全消除LAG-3对CD4细胞的作用，强调KIEELE对LAG-3抑制通路的重要性。此外，对KIEELE残基的丙氨酸基因图表扫描显示，赖氨酸残基K468是LAG-3下游信号通路所必须的，E470和E471对CD4的贡献较小。但是，根据Maeda和同事的研究，LAG-3通过两种不同的机制介导胞内固有、独立于KIEELE的负抑制信号，这两种信号依赖于近膜区的FxxL模块和羧基末端的EP重复序列。
EP重复序列存在于不同物种和不同细胞位置的蛋白质中，可能是某种未知共同生物功能的指标。比如，PDGF-R、LckBP1和SPY75都有相似的EP区在信号机制中发挥作用。有人提出，EP序列通过和LAP蛋白（LAG-3相关蛋白）结合，使LAG-3能和CD3、CD4、CD8在脂筏中共定位，是抵消CD3/TCR活化通路功能的关键。根据Workman的研究，EP模块缺失或S484突变仍可保持LAG-3的活性和对CD4+/CD4-T细胞的作用，意味着这两个部分不是必要的。然而，必须强调的是，只有同时除去KIEELE和EP模块时，LAG-3在CD4-T细胞的抑制功能才会被完全阻碍。作者提出，EP模块可以抑制LAG-3像CD4一样发挥刺激共受体作用，而不是和KIEELE共同作用于抑制信号转导。
LAG-3在抗原刺激后定位在脂筏上，它的胞质结构域可能介导LAG-3在细胞膜上的定位。LAG-3与富含CD3、CD4或CD8的糖鞘脂质微域复合物共定位。在TCR参与后，LAG-3与CD3和神经节苷脂GM1在免疫突触共定位。然而，迄今为止还没有关于这些模体及其功能的系统性后续研究结果。需要阐明LAG-3的结构，以了解其调节T细胞活化的作用机制。
除了在细胞膜表面表达，LAG-3还储存在溶酶体中，并由其胞质结构域通过蛋白激酶C信号通路，转移到活化的T细胞细胞膜上。
（三）LAG-3受体
MHC-II是LAG-3的受体，结合位点是D1结构域，可以负性调节T细胞活化、细胞毒性、产生细胞因子。LAG-3和MHC-II的亲和力远高于MHC-II和CD4，是CD4/MHC-II依赖性细胞黏附试验的竞争者。LAG-3结合MHC-II后，通过胞质结构域传递抑制性信号，抑制CD4 T细胞活化，但是具体的信号转导分子机制仍不明确。LAG-3/MHC-II结合有助于肿瘤从凋亡逃逸，促进肿瘤特异性CD4 T细胞招募，但是降低CD8 T细胞应答。
起初，研究人员认为LAG-3/MHC-II高亲和力结合是LAG-3竞争性抑制CD4/MHC-II结合的主要机制。然而由于最近发现了其他受体，是否由LAG-3/MHC-II相互作用单独介导LAG-3免疫抑制功能仍存在争议。
第二个LAG-3受体是半乳凝素-3/Gal-3，一种31kDa的半乳糖结合凝集素，可以调节T细胞活化。Gal-3在多种肿瘤细胞和活化T细胞中高表达。Gal-3结合LAG-3是CD8 T细胞细胞毒性功能抑制必须的。Gal-3通过肿瘤微环境中表达的LAG-3抑制活化的抗原募集CD8 T细胞和抑制浆细胞样树突细胞扩张，形成抗肿瘤特异性免疫应答。
肝分泌蛋白纤维蛋白原样蛋白1/FGL1是最近新发现的一种LAG-3功能性受体。FGL-1属于纤维蛋白原家族，有免疫抑制活性，通过结合LAG-3抑制抗原特异性T细胞。FGL-1的纤维蛋白原样结构域结合LAG-3的D1和D2抗体样结构域。IL-6诱导FGL1表达，在肝癌、前列腺癌、黑色素瘤、结肠癌等肿瘤中高度上调。据研究，血浆FGL1水平提高与肿瘤预后不良和抗PD-1治疗耐药相关。因此，LAG-3/FGL-1被称为新的免疫逃逸机制，在临床前模型中阻断这一结合可以增强抗肿瘤T细胞免疫。阻断FGL-1/LAG-3结合和抗PD-1/PD-L1治疗可能有协同作用。LAG-3 D1C'链的单点突变Y73F可以破坏LAG-3/MHC-II结合，但不会破坏FGL1-Ig结合。然而，这种突变的LAG-3仍可以抑制T细胞，说明FGL1/LAG-3相互作用和一种独立于MHC-II结合的肿瘤免疫逃逸机制有关。
综上所述，LAG-3和多种受体的相互作用对其抑制性功能非常重要，而且LAG-3并非主要通过破坏CD4/MHC-II相互作用来发挥功能。
二、LAG-3表达的调控
（一）组织细胞表达
多项研究分析了LAG-3在小鼠细胞、人类血细胞和其他组织中的表达情况。LAG-3在活化的CD4辅助T细胞/Th和细胞毒性CD8 T细胞CTL等多种不同T细胞亚型中表达。除了Th2，大部分活化的CD4分化细胞亚群如Th0、Th1都表达LAG-3。T细胞活化似乎是LAG-3在细胞膜表面表达的必要条件。在活化的T细胞上，IL-2、IL-12等细胞因子也可以上调LAG-3表达，且LAG-3表达和IL-10生成增加相关。细胞表面的LAG-3表达和LAG-3脱落和IFN-γ的产生关系密切，IFN-γ是一种强效MHC-II诱导因子。另外，LAG-3表达和IL-3的产生负相关。LAG-3经脂筏转移到细胞膜后和CD3、CD4/CD8集群共定位。据报道，在人类卵巢癌中，LAG-3可以负性调控肿瘤浸润的抗原特异性CD8 T细胞；肺癌中，外周血T细胞PD-1/LAG-3共表达是T细胞严重功能紊乱的生物标志物。
NK细胞各亚型和不变NKT细胞都表达LAG-3。事实上，lag-3基因位点和NK基因复合体相近，在活化NK细胞中表达。但是LAG-3并不参与人类NK细胞的特定自然杀伤模型。
LAG-3在活化效应分子CD4 T细胞，特别是在活化的自然T细胞nTreg和调节性T细胞iTreg中表达。Foxp3-CD25low
IL-10+ type 1 regulatory T cells (Tr1)也高表达LAG-3，LAG-3和CD49b+共表达可用于识别Tr1特征。IL-27/LAG-3轴能增强Treg抑制功能。总之，iTregs和nTregs发挥最大抑制功能需要LAG-3表达。
耗竭的CD8 PD1肿瘤浸润淋巴细胞TILs也表达LAG-3。但TILs的LAG-3表达和食管癌、NSCLC、HKL和微卫星不稳定CRC的良好预后相关，因此这一现象在免疫逃逸中的作用尚有争议。TILs表达LAG-3和抗原特异性CD8 T细胞功能抑制相关。此外，LAG-3和其他免疫检查点分子（CD274、IDO1）在TILs中共表达
可以作为肿瘤预后的预测生物标志物。
据称，活化B细胞表达LAG-3是T细胞依赖的。慢性淋巴细胞瘤细胞中也发现LAG-3高度表达，特征是 (CD5+ CD23+ CD27+ Iglow)成熟B细胞克隆扩增。自然调节浆细胞亚型(LAG-3+CD138hi plasma cells, or
Bregs)按照B细胞受体/BCR依赖的方式分化，也表达LAG-3。这一细胞亚型表现出独特的浆细胞特异性表观/转录特征和分子程序。在这种情况下，布鲁顿酪氨酸激酶(Btk)和BCR信号通路独立于TLR信号通路和T细胞帮助，控制LAG-3+ Bregs的发育。与此相反，Khsheibun和合作者发现了在EB病毒转化的细胞中，无需T细胞辅助即可表达LAG-3 mRNA和蛋白。
有证据表明，LAG-3还在其他不属于淋系的细胞中表达，如浆细胞样树突细胞pDCs。LAG-3通过细胞内源性和外源性方式选择性调控CD11clow B220+ PDCA-1+ pDC细胞稳态。活化的pDC可以分泌五倍于活化T细胞的可溶性LAG-3。尽管其他的DC亚群中不表达，可溶性LAG-3在GM-CSF和IL-4存在时，可以使人类单核细胞来源的DC细胞产生有效的表型、功能成熟和激活。另外，LAG-3诱导成熟DC分泌IL-12和TNF-α炎性细胞因子，有较强的同种异体刺激能力。事实上，由于LAG-3有使人类单核细胞来源的DC完全成熟的能力，将它与免疫球蛋白融合已被应用于强效疫苗佐剂。
LAG-3在神经元中也有表达，和病理性α突触核蛋白特异性结合并共同被内吞。
（二）LAG-3的遗传和表观遗传调控
lag-3转录产生4个转录本或剪接变体lag3-201,
lag3-202, lag3-203, lag3-204。Lag-3基因可分为190个直系同源基因(灵长类26个，啮齿动物30个......)和10个旁系同源基因(IL18RAP、SIGIRR、IL1R2、IL1RL1、IL1RAPL2、IL18R1、IL1RAPL1、IL1RAP、IL1R1、IL1RL2)。Lag-3是1 Ensembl蛋白家族(PTHR11890/白细胞介素1受体及其前体家族)和人类CCDS集(CCDS8561.1)的成员。lag-3基因在GRCh37坐标(CM000674.1)上定位于6,881,678-6,887,621，其位点对应于12号染色体:6,772,512-6,778,455的正链。LAG-3蛋白被分配给P18627 UniProtKB标识符。
lag-3基因表达两个具有相同转录起始位点的规范转录本。相比完整蛋白LAG3-201，LAG3-202转录本没有最后三个外显子。图中还显示了扩展的启动子和转录抑制因子CCCTC结合因子的结合位点。
Lag-3转录的表观遗传调控尚不明确，可能涉及DNA甲基化，DNA甲基化已被证明在各种癌症中调节PD-1、PD-L1和CTLA-4的表达。例如，PD-L1启动子的甲基化情况可用于结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌和急性髓系白血病的生存预测；PD -1启动子甲基化与前列腺癌无复发生存RFS相关；CTLA-4甲基化与黑色素瘤抗PD-1、抗CTLA-4免疫治疗中的反应相关；TP53相关的免疫预后标志(TIPS)与TCGA队列中LAG-3和其他关键免疫检查点生物标志物的高表达呈正相关。
LAG-3启动子中的CpG岛高度低甲基化。在原发性乳腺癌组织中，组蛋白3赖氨酸9 (H3K9)和赖氨酸27 (H3K27)表现出三甲基化，和启动子区抑制性组蛋白的低富集有关。在肾透明细胞癌中，LAG-3基因的DNA甲基化水平与肿瘤细胞、免疫细胞的LAG-3表达、免疫细胞浸润、转录活性和总生存率相关。说明Lag-3表达可能经甲基化进行表观遗传调控。研究表明，皮肤T细胞淋巴瘤中，Lag-3的表达受到microRNA-146的负性调控。黑色素细胞瘤中，类特异性或类选择性组蛋白去乙酰化酶6 (class-specific or class-selective histone deacetylase 6, HDAC6)抑制可下调T细胞中LAG-3的表达，从而缓解T细胞抑制。也有报道关于TIM-3、PD-1和PD-L1表达的类似影响。
转录因子Egr-2可影响CD4 CD25-LAG-3+调节性T细胞的活性，可能也涉及LAG-3转录。分泌IL-10的Egr-2+ LAG-3+ CD4 Tregs可能是控制外周免疫的关键。基因相关性分析发现DHEA-Box Helicase 37 (DHX37)的表达与Lag-3相关。
证据表明，LAG-3蛋白表达与T细胞的“表观遗传学衰竭状态”有关。从这些研究中可以得出结论，DNA和组蛋白修饰参与了肿瘤中LAG-3的上调，这表明表观遗传修饰水平可能作为免疫检查点封锁免疫疗法疗效的潜在预测生物标志物。还需要进一步的研究来确认甲基化在癌症中功能紊乱的细胞免疫表型中的作用，以及明确其作为一种潜在的诊断/预后生物标志物和治疗靶点的作用。
三、LAG-3与疾病
（一）肿瘤
T细胞表达LAG-3被认为是多种肿瘤侵袭性进展的标志，包括黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、结肠癌、卵巢癌、肝细胞肝癌、肾细胞癌、胃癌、滤泡细胞癌follicular lumphoma、前列腺癌、头颈鳞癌、非小细胞肺癌、恶性胸膜间皮瘤malignant pleural mesothelioma，乳腺癌、肛门鳞癌anal、胰腺癌、口腔鳞癌oropharyngeal、尿路上皮癌urothelial等。
LAG-3还被认为是多瘤种（如胰腺导管腺癌）中驱动T细胞耗竭的分子。
LAG-3表达的肿瘤通常生存期差，但也有例外。LAG-3高表达的早期结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤ENKTL、NSCLC、三阴乳腺癌TNBC (triple-negative breast cancer)、乳腺癌表现出较好的OS和PFS。
在多种恶性肿瘤中，LAG-3和PD-1共表达和不良疾病预后相关。LAG-3在肿瘤抗原特异性T细胞中表达上调意味着细胞介导的免疫功能受损和T细胞增殖功能失调。免疫检查点分子在原发和转移肿瘤微环境中的表达可用于预测预后。
其他疾病：帕金森病、心血管疾病、高密度脂蛋白高胆固醇血症、炎症性肠炎、多发性硬化、糖尿病、感染。
四、LAG-3靶向治疗的临床进展
肿瘤免疫疗法，如免疫检查点抑制剂疗法，可以刺激免疫系统识别和消除肿瘤细胞，也可以增强对感染原的应答。肿瘤免疫疗法主要作用于活化T淋巴细胞。然而，并不是所有的患者对这些治疗都有反应，意味着一个重要的临床、经济和伦理问题。在抗原提呈过程中调节T细胞活化的抑制性共受体是非常重要的免疫检查点。这些分子通常与TCR一起存在于免疫突触中，并调节其信号转导能力，如PD-1、CD244、CD160、TIM-3、CTLA-4和LAG-3。ICIs阻断PD-1/PD-L1相互作用为癌症治疗带来了非常有前景的改变。得益于第一代ICIs的有效性，第二代ICIs，如抗LAG -3抗体和组合疗法正在临床前和临床期评估。
早在2006年，因其可溶性蛋白的免疫刺激活性(eftilagmod alpha, IMP321)，LAG-3-Ig融合蛋白在临床试验中被开发。目前，有几种抗LAG-3的免疫治疗模型处于临床和临床前开发的不同阶段。还有研究将LAG-3与其他免疫检查点(PD-1、PD-L1、TIM-3、CTLA4)联合。新一代双特异性PD-1/LAG-3抗体已显示出强大的特异性靶向高度功能紊乱的PD-1+LAG-3+的T细胞、增强其增殖和效应活性的功能。