Nature | 单细胞测序揭示核染色体的位置决定了分离错误的频率
原创 骄阳似我 图灵基因 2022-07-20 07:13 发表于江苏
收录于合集#前沿分子生物学机制
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撰文：骄阳似我
IF：69.504
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亮点：
1.细胞分裂过程中的染色体分离错误会产生非整倍体和微核，它们可能会发生广泛的染色体重排，然后选择性压力形成不同的非整倍性和重排模式，但是不知道特定染色体是否存在分离错误和微核化的初始偏差。在未转化的二倍体细胞系和类器官中使用单细胞DNA测序，显示染色体具有不同的分离错误频率，导致非随机非整倍性景观。从这些细胞中分离和测序单个微核显示错误分离的染色体经常也优先被包埋在微核中。
2.在两种癌细胞系的天然存在的微核中发现了类似的偏倚。本文发现单个染色体的分离错误频率与其在间期细胞核中的位置相关，并且表明这对于纺锤极后面的外周染色体是最高的。染色体位置的随机化，Cas9介导的实时跟踪和单个染色体的强制重新定位表明，与核中心的距离越大，直接增加了错误分离的倾向。因此，癌症基因组中的色癣菌和早期发育中的非整倍性对于较大的染色体更频繁地发生，较大的染色体优先位于核周边附近。
近期，研究人员在Nature杂志上发表了一篇名为“Nuclear chromosome locations dictate segregation error frequencies”的文章，本文的发现揭示了核染色体位置，分离错误频率和微核含量之间的直接联系，这对我们对肿瘤基因组进化的理解以及发育过程中特定非整倍性的起源具有重要意义。
染色体分离错误频率
为了检查单个染色体错误分离的倾向，本文使用单细胞核型测序（scKaryo-seq）评估经历异常有丝分裂的二倍体细胞的数百种核型。scKaryo-seq允许高保真度和高通量确定单细胞中所有染色体的拷贝数状态。在存在或不存在低浓度（62.5nM）Cpd-5（有丝分裂激酶MPS1的小分子抑制剂）的情况下，允许在G2中同步的RPE1-hTERT细胞进行有丝分裂。低Cpd-5会影响附着错误校正和SAC反应，导致几乎所有细胞都经历后期，少数染色体错位和滞后（图1a）。在容易出错的有丝分裂后4小时分离的单个细胞核进行scKaryo-seq。低Cpd-5导致每个非整倍体细胞平均5.5个分离错误事件，总共2417个可量化的整体和结构染色体拷贝数改变（图1b）。注意的是，非整倍体景观揭示了染色体间的分离错误概率不相等：染色体1-5、8、11和X的错误分离概率显著高于随机错误频率4.3%的预期。另一方面，染色体14、15和19-22的概率明显较低（图1c）。后期数字中染色体1,2,4,6,10,11,15和X的着丝粒的荧光原位杂交（FISH）进一步证实了scKaryo-seq观察到的非随机非整倍性景观是由于偏倚分离错误造成的（图1d，e）。重要的是，当通过其他方式诱导有丝分裂错误时，可以看到相似的分离错误概率。首先，Aurora B的小分子抑制虽然在单层培养物中引起严重错误，但在人肠类器官中引起轻微的分离错误，允许分离子核。这些细胞核的scKaryo-seq显示出与Cpd-5处理的细胞高度相似的分离错误偏倚（图1f，g）。总之得出结论，非转化细胞中各种来源的染色体分离错误是非随机的。图1：错误倾向期间染色体的分离错误频率是非随机的。
染色体微核频率
错误分离的染色体经常被包裹在微核中。微核中的染色体可以经历广泛的重排，例如色杆菌病，其在肿瘤进化中起重要作用。因为在分离错误后观察到初始非整倍性景观的偏差，本文检查了这是否会转化为有偏差的微核含量。因此采用基于荧光激活细胞分选仪（FACS）来分离微核并通过测序评估其含量，称之为MN-seq。对来自Cpd-5处理的细胞的单个或大量分选的微核进行的MN-seq显示出显着的非随机含量，其与染色体的错误分离频率模式强烈相关（图2a-d）。接下来检查了癌细胞天然存在的微核中微核含量是否非随机，五个染色体不稳定的癌细胞系的MN-seq显示所有细胞系中都存在非随机微核含量，并且两个细胞系（Caco-2和HeLa）显示出与Cpd-5/AurBi处理的二倍体高度相似的偏倚（图2e，f）。注意的是，最近的FISH分析显示胶质母细胞瘤细胞中存在类似的微核含量偏倚。这些数据表明，具有较高错误分离概率的染色体更频繁地被包埋在微核中。因为天然存在的微核很可能是由相对较新的错误分离事件引起的，数据进一步表明，各种癌细胞中的分离错误是非随机的，并且可能是由相似的潜在机制引起的。图2：微核含量反映了偏析误差偏差。
非随机隔离错误的起源
已经确定所有染色体中微核中错误分离和截留的频率不相等，接下来了解这种偏倚的起源。RPE1-hTERT细胞中染色体的分离错误频率与层板相关染色体结构域（LAD）的密度（图3a）以及染色体与核中心的公布距离强烈相关。六个染色体（1、2、6、15、17和18）的着丝粒FISH在未转化和转化的细胞系中进一步证实了这一点（图3b，c）。为了进一步探索染色体位置可能导致分离错误偏倚，在具有标记的着丝粒和中心体的细胞中对有丝分裂期间的染色体运动进行实时成像（图3d）并分析了轨迹。结果表明在不受干扰的条件下，在用Cpd-5处理后更容易作为错位或滞后的染色体错误分离（图3e–h）。在染色体不稳定的癌细胞中观察到类似的现象，其中外周极性染色体根据极性频率错位的可能性比预期的高三倍（图3i，j）。此外，在具有这种错位中期染色体的细胞中，后期的错位和滞后现象明显多于没有错位的细胞（图3k），这表明错误分离的染色体可能经常出现未对齐的染色体。这些结果表明，染色体的外围位置，甚至更重要的是，这个位置如何与纺锤极相关，延迟了生物定向，从而导致外围染色体错误分离的高频率。图3：分离错误概率与核染色体位置相关。
核染色体定位的作用
接下来检查间期细胞核中染色体不同位置是否直接导致分离错误概率的变化。在第一种方法中，在诱导错误的后期之前随机化染色体在有丝分裂中的位置。这是通过monastrol的短暂处理完成的，其允许在单极纺锤体中基于微管的染色体运动，并且同时使得大多数染色体基本上是纺锤体极近端的（图4a，b）。从monastrol释放到低Cpd-5的细胞的scKaryo-seq显示在两种不同的细胞系中，染色体错误分离的可能性发生了实质性变化（图4c）。在第二种方法中，利用重复特异性指导RNA和荧光标记的dCas9对特定染色体成像的能力。平均而言大部分为外周的染色体偶尔会在核内部发现，反之亦然。这使能够将特定染色体的位置与其在有丝分裂中的行为直接相关（图4d）。在Cpd-5处理的细胞中，从外周位置开始的染色体在后期开始之前显着更经常错位，与从更中心位置开始时相比（染色体1为三倍，染色体9为四倍）（图4e）。重要的是，与中心起始位置（染色体1和9分别为1.8倍和2.5倍）相比，外围起始位置显着增加了错误分离率（错位和滞后）（图4f）。在最后一种方法中，通过dCas9和Lamin B1的rapalog控制的二聚化将染色体9从中心位置有条件地束缚到核层，从而迫使染色体9从中心位置迁移到外围。与rapalog孵育24小时后，在外周附近发现9号染色体的频率增加了近两倍（图4g，h），这本身并不影响其在正常分裂期间的正确分离（图4i）。然而，在添加Cpd-5后容易出错的分裂后，与未重新定位的9号染色体相比，9号染色体的重新定位导致其错误分离率增加了近两倍（图4i）。综上所述，染色体分离错误频率直接受到有丝分裂开始前间期细胞核位置的影响。图4：染色体与核中心的距离决定了分离概率。
本文数据与一个模型一致，在这个模型中，染色体在细胞核中的位置决定了单个染色体分离错误的概率以及它们在微核中的捕获。本文认为外围染色体比中央染色体错误分离的频率更高，因为它们需要行进更远的距离才能到达中期板，更经常地经历横向或线粒体微管相互作用和/或由于位于纺锤极后面而经历额外的延迟。因此，这可能是导致染色体不稳定的过程的常见结果，与破坏SAC，附着错误校正或微管动力学时发生的偏向分离一致。然而，来自不同潜在过程的其他偏差可能存在，并且可能例如影响人类女性减数分裂中的非整倍性。值得注意的是，在人类胚胎的前几个容易出错的有丝分裂之后，染色体大小也与非整倍性景观相关。在小鼠中，这些分裂过程中的错误归因于SAC减弱。因此，染色体的核位置也可以解释胚胎发育过程中的非随机非整倍性。有趣的是，最近对2658种人类癌症中的色素沉着事件的调查显示，它们的发生与染色体大小密切相关，因此与核位置密切相关。因此，非随机分离错误可能会影响癌症中复发的非整倍性和基因组重排模式的动态，从而影响肿瘤的生长，转移和复发，组织特异性染色体位置可能会差异地影响这些动力学。
教授介绍：
Geert J. P. L. Kops
Geert Kops是乌得勒支大学医学中心分子肿瘤细胞生物学教授，他研究癌症的起源，这涉及到观察携带生物体遗传（DNA）一部分的染色体。Geert J.P.L.Kops主要关注细胞生物学，有丝分裂，Akt/PKB信号通路，FOXO4和Forkhead转录因子。他的细胞生物学研究是多学科的，包括细胞周期检查点，Mad2，纺锤体检查点，细胞周期和动粒的元素。他在动粒研究中整合了有丝分裂退出和后期等领域的主题。
Kops试图揭示细胞分裂过程中染色体分离的分子原理，并关注许多对这一过程至关重要的酶。这是令人感兴趣的，因为染色体分离中的缺陷可能导致人类发展中的严重问题，并且有强烈迹象表明这些缺陷有助于癌症的发展。Kops的分子研究结果将为进一步应用于癌症的研究奠定基础。与乌得勒支大学医学中心，Hubrecht研究所和NKI AvL等机构的同事一起，他的研究结果被用于进一步开发该疾病的新疗法。因此，基础研究间接地为改善癌症患者的预期寿命和生活质量做出了重要贡献。
参考文献：
Klaasen, S.J., et al., Nuclear chromosome locations dictate segregation error frequencies. Nature, 2022.