今天跟大家分享的是三月份发表在NATURE COMMUNICATIONS杂志（IF：11.878）上的一篇文章Immunogenomic profiling determines responses to combined PARP and PD-1 inhibition in ovarian Cancer，文章主要讲的是从免疫基因组的角度对使用niraparib和pembrolizumab用药的患者进行分析，发现两个决定药物响应的标志，单细胞成像分析药物响应机制，分析个体样本内单细胞空间特征等。
Immunogenomic profiling determines responses to combined PARP and PD-1 inhibition in ovarian Cancer
免疫基因组分析确定了卵巢癌患者中对PARP和PD-1联合抑制的响应因素
聚(ADP-核糖)合成酶抑制剂（PARP抑制剂）可谓是近几年一大热门药物，是第一种利用联合致死关系，通过阻碍肿瘤细胞的修复机制来达到杀伤肿瘤目的的药物。2014年以来，已经有4种PARP抑制剂获FDA批准上市用于卵巢癌、乳腺癌和胰腺癌等治疗，并且在2019年年底，PARP抑制剂Olaparib已获中国国家药监局批准，用于BRCA突变的晚期卵巢癌患者的一线维持治疗。免疫抑制的火热程度更不用提，是通过激活机体免疫系统实现对肿瘤细胞的杀伤的目的。那么让我们一起来看看这两大热门疗法的组合应用分析吧~
一、摘要
虽然已经有多项研究显示PARP和免疫检查点联合抑制在卵巢癌中有协同抑制肿瘤的作用，但依旧面临缺乏预测的生物标志物的问题。所以本工作对使用niraparib（PARP抑制剂）和pembrolizumab（PD-1抑制剂）的卵巢癌患者进行了免疫基因组分析和高度复用的单细胞成像分析，识别了与药物响应有关因素。
二、方法解读
1. 样本
62名复发性卵巢癌患者使用niraparib 和pembrolizumab联用的I/II期临床试验（TOPACIO trial），76%的患者有获得性铂类耐药或难治性疾病，剩下的 24%患者由于毒性或过敏反应，没有资格接受铂治疗。
30个样本诊断时获得的肿瘤样本(未接受化疗的样本，chemo-naive)，32个接受铂类化疗后的样本（chemo-exposed）。
2. 用于判断样本的HRD（同源重组修复缺陷）指标
（1）Myriad Genetics 分析：进行BRCA突变（tBRCAmut）检测和 HRD（同源重组修复缺陷）检测。
（2）BROCA检测：84个DNA修复相关基因的测序（提供基因列表），以及BRCA1和RAD51C的甲基化分析。
（3）免疫组化(IHC)评估RAD51，因为RAD51是 HR 缺陷的功能marker。
（4）OncoPanel测序：对肿瘤纯度>20%的样本（35个）测序，测447个癌相关基因的突变（单核苷酸变异、插入和缺失）和拷贝数变异（提供基因列表）。
（5）多元特征计算工具SigMA（Signature Multivariate Analysis），是一个能够从低突变counts中精确的发现与HRD相关的突变特征的工具。首先使用来源于ICGC project和cBioPortal的卵巢癌的单核苷酸变异（SNV）体细胞拷贝数变异（SCNA）数据对SigMA工具进行优化。然后对OncoPanel测序数据进行SigMA分析，识别与HRD相关的突变特征（命名为突变特征3，Sig3）。
3. NanoString基因表达分析（提供基因列表）
（1）PanCancer IO 360 Gene Expression Panel 提供的770个参与了肿瘤、微环境和癌症免疫反应之间复杂的相互作用的基因，
（2）30个DNA修复相关的基因
NanoString 分析输入（1）（2）两部分基因表达数据，使用NanoString NSolver Advanced Analysis分析平台对数据进行分析，生成通路类型和细胞类型的scores。
在未化疗的样本中，若在三种干扰素通路中的任何一个score≥25% ，认为这些样本是免疫评分（IS）阳性的，其余为阴性；在化疗后样本中，若CD8 + Tcell/CD8T-cell score≥25%，认为这些样本是IS阳性的，其余为阴性。
综合评分使用Sig3和IS，若样本Sig3或IS为阳性，那么该肿瘤的综合评分判定为阳性；若Sig3且IS都为阴性，则该样本的综合评分为阴性。
4. 单细胞成像数据分析
使用R包flowSOM对细胞计算细胞型标签（stromal cells、 tumor cells和immune cells）。对数据使用半监督的UMAP降维来实现可视化。通过与1000次的随机扰动比较，使用fold-change 定义细胞互作出现的显著性，将细胞互作划分为“吸引”和“躲避”。
5.荧光原位杂交法（FISH）评估样本中PD-L1和 PDL2 。。
三、 结果解读
1. 与临床获益相关的突变特征3（Sig3）
为了识别与临床获益相关的特征，使用不同的评估方法将样本划分为HRD阳性和阴性。发现SigMA方法能够识别最大比例的HRD阳性（图1a），Fisher’s检验发现，只有SigMA方法分类的样本与药物响应相关（图1b），Sig3阳性的样本临床受益（完全缓解、部分相应或疾病稳定）。图1c展示根据Sig3分类的样本在疾病进展（PD）、疾病稳定（SD）和部分响应（PR）的患者中分布情况。Sig3阳性患者联合使用niraparib 和pembrolizumab有较好的无复发生存期（PFS）（图1d）。
图1.突变特征3与延长无进展生存期相关
2. 免疫打分（IS）和 Sig3能识别所有的客观响应患者
为了了解免疫微环境，使用NanoString基因表达分析发现化疗前和化疗后的样本免疫环境中基因表达模式有显著不同，化疗后样本免疫相关通路和免疫细胞score打分高，这些样本与免疫组化检测的PD-L1 正相关。
可以发现，化疗前后的样本在多方面有差异，所以下面的分析将两类样本分别分析。在无化疗样本中，使用Mann-Whitney U检验研究药物响应与非响应患者的通路差异，发现响应的样本有六个通路显著富集（图2a），在这些通路中，有3个与Type-I干扰素信号通路相关，这些通路也与客观响应率显著相关（图2b）。在化疗后样本中，观察到相对的exhausted CD8 + T-cells（衰竭CD8 + T-cells）在响应组的cell-type scores高于非响应组（图2c）（这里的“相对的”指的是相对于整体肿瘤浸润性淋巴细胞的打分），exhausted CD8 + T-cell 的cell-type scores（由CD244、EOMES、LAG3和 PTGER4的基因表达值计算）相对于总体CD8 + T-cells（由CD8a和CD8b计算）的，在响应组要高于非响应组（图2d）。
Fisher’s检验发现，IS（免疫打分，方法中有介绍）与OR显著正相关（图2e），图2f的瀑布图所示，所有肿瘤衰退的患者（限定衰退比例≥30%）中，Sig3或IS或两者都呈阳性。综合评分（方法中有介绍）与临床获益相关（图2g），与延长PFS相关（图2h）。综合评分为阴性的患者无OR（图2i）。
图2.免疫特征与肿瘤进展和客观响应相关
3. 单细胞成像反应药物响应机制
使用t-CyCIF对26个肿瘤进行高度多重化单细胞成像，可以识别免疫细胞类型和测定功能细胞状态。t-CyCIF的细胞表达定量分析发现，样本中所有细胞的平均markers水平与治疗反应或其他临床特征无关（图3a）。接下来，使用FlowSOM对细胞分类，用统一流形逼近与投影（UMAP）降维来可视化数据（图3b）。接受化疗导致肿瘤细胞比例降低，免疫细胞和基质细胞的比例比未接受化疗的样本更高（图3c）。
鉴于表达谱研究结果显示Type-I干扰素信号显著富集在对niraparib/pembrolizumab有应答的患者样本，使用phospho-STAT1 (pSTAT1)表达作为干扰素激活的标记，评估了肿瘤微环境中细胞类型的干扰素通路激活情况。Mann-Whitney U检验结果显示在PD-1高表达的exhausted CD8 + T-cells中，pSTAT1蛋白的表达与OR和临床获益显著相关（图3d，e）。在CD8 + effector T-cells，pSTAT1和Ki67（是增殖的指标）表达增加与客观响应相关（图3e，f），二者在响应组的表达高于非响应组（图3h）。
图3.干扰素激活和CD8 + T-cells增殖状态与药物响应相关
4. 独特的单细胞空间特征的极端响应案例
接下来工作是对两个异常反应患者的样本进行了更深入的表型分析,这两位患者都是铂类耐药，用药后经历了长期的部分响应阶段。第一个病人的PR持续了10个月，从基线开始有87%的肿瘤消退（图4a），她的肿瘤中Sig3呈阳性，BROCA分析显示BRCA1的高甲基化和TP53功能缺失的突变，肿瘤中CD163 + IBA1 + CD11b +巨噬细胞和exhausted CD8 + T-cells 富集（图4b）,CD163 + IBA1 + CD11b +巨噬细胞中PD-L1高表达（图4c，d）。对样本中细胞类型进行空间聚类，exhausted CD8 + T cells的邻居包括PD-L1 +巨噬细胞和树突状细胞（图4e，f）。这个现象说明巨噬细胞或树突状细胞与exhausted CD8 + T cells之间的互作用可能是该样本PD-1/PD-L1介导的免疫抑制中最相关的细胞-细胞相互作用。
第二个极端响应者为PR，持续响应时间超过一年，有53%的肿瘤消退。样本是Sig3阳性，有PD-L1和PD-L2扩增（图4g）。邻近分析显示有CD8 + Tcells和PD-L1阳性的肿瘤细胞的聚集，而PD-L1阳性的巨噬细胞则单独聚集（图4h）。此外，exhausted CD8 + t细胞在空间上与PDL1+肿瘤细胞聚集在一起，而邻近的PD-L1-阳性巨噬细胞在空间上单独聚集（图4i）。该样本有丰富的免疫抑制PD-L1/PD-1信号，特别是在PD-L1-阳性的癌细胞中。
为了证实上述，在高倍放大下对感兴趣的区域进行了12-marker tCyCIF，这种类型的成像是提高分辨率>3倍（图4j）。结果发现第一个患者巨噬细胞中PD-L1高表达，与巨噬细胞邻近的exhausted CD8 + T-cells中PD-1和PD-L1有强染色。第二个样本的肿瘤细胞室有清晰的PD-L1染色，exhausted CD8 + T-cells与肿瘤细胞接近，而非巨噬细胞。
图4.两例极端反应的肿瘤在肿瘤微环境中表现出不同的细胞相互作用的空间模式
5. Exhausted CD8 + T-cell互作与响应相关
接下来对26个样本的t-CyCIF数据进行统计邻域分析，以确定肿瘤微环境中细胞亚群的空间相互作用是否与响应相关。实验观察到巨噬细胞、抗原提呈细胞和T细胞亚群对exhausted CD8T-cells细胞的吸引（图5a）。Exhausted CD8 + T-cells与巨噬细胞的相互吸引与药物响应显著相关（图5b）。还发现相对于非响应者，应答患者有高比例的PD-L1-positive巨噬细胞（图5c）和肿瘤细胞（图5d）邻近 exhausted CD8 + T-cell。相比于Sig3 阴性肿瘤，在Sig3阳性肿瘤中，与exhausted CD8 + Tcells互作的PD-L1-positive肿瘤细胞的比例更高（图5e），说明在sig3阳性的肿瘤中，exhausted CD8 + T-cells被PD-L1-positive肿瘤细胞包围的频率高于sig3阴性肿瘤。图5f展示本研究主要结果的图形总结。
图5.exhausted CD8 + T-cells的空间相互作用与响应和突变特征3相关
总结:
本工作对使用niraparib和pembrolizumab用药的患者进行分析，发现决定药物响应的标志。首先使用基于HRD的SigMA分类方法识别的突变特征3，发现使用特征3分类的样本与响应情况相关（Sig3为第一个响应标志）。然后基于肿瘤免疫和DNA修复相关基因的表达值，对样本进行通路和细胞类型的免疫打分，发现IS与OR正相关（IS为第二个响应标志）。接下来用单细胞成像分析药物响应机制，发现干扰素激活与OR和临床反应相关。然后对两个案例进行了具体分析，发现两个案例中的exhausted CD8 + T cells与巨噬细胞的互作及聚集情况。最后分析了样本的细胞群，发现exhausted CD8 + T-cells与巨噬细胞的相互吸引与药物响应显著相关。