qPCR（荧光定量PCR）的Ct值
今天我们要说的问题，也是对qPCR的更高阶的认识。
1、Ct值到底是不是YYDS？
2、Ct值跟哪些因素有关？
3、同样的模板，Ct值大试剂盒就差吗？要不要换试剂盒？
还是从这个盗版来的图说起。你必须明白以下几个概念和问题。
Ct值-阈值-基线
1、阈值循环数（Cycle threshold，Ct值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。Ct值与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始模板浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。这就是荧光定量PCR的理论基础。
2、阈值怎么确定呢？阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的10倍。为什么是10倍，而不是5倍8倍？就是为了和基线拉开距离，证明PCR扩增进入指数扩增期。为什么不是20倍30倍？因为每个一PCR循环都会放大误差，而此时误差还未被放大。我们当然可以把阈值设置到30个循环，但是30个循环以后，扩增效率和其它误差带来的数据偏差，估计他妈妈都不认识了。
3、基线又是怎么确定呢？基线（baseline）通常是3-15个循环的荧光信号，同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线。
很显然，基线一变，阈值就改变了，阈值改变，Ct值就跟着改变。由于每次实验的样本和仪器，甚至混合情况不一样，使得基线有所差异，最终会影响Ct值。所以拿上一次实验的样本去检测本次实验的Ct值是否一致，本身就是刻舟求剑，没有可比性，所以童鞋们应该明白了，为啥qPCR一做就要放在一起做，就是这个原因。
Ct值跟哪些因素有关？
按照影响的严重性进行描述：仪器＜耗材＜试剂＜＜＜样本浓度，越往后面越严重。这是肯定的了，如果仪器耗材试剂都能很大程度上影响对样本浓度的测定，那这就是一个失败的测试。
仪器：很显然，仪器对荧光信号检测的敏感度，以及计算软件，都会影响到Ct值。我们一旦买了一台仪器，这些因素就已经确定了。高校实验室的仪器几乎都是清一色的进口品牌：ABI、Bio-Rad、Roche，几十万一台，你几乎无法找他们的麻烦。
耗材：很多童鞋会忽略耗材的影响，其实耗材的选择是非常重要的，荧光信号强不强，先过耗材这一关，你用的板子是什么板？白色or透明；用的好是数据看板，用的不好就是仙人板板。用的膜是什么膜？高透or普通；好的膜就跟没有一样，就如同管理，最好的管理就是没有管理”太上，不知有之“。适配性怎么样？我们曾经做过一个qPCR金标准耗材的选择表，感兴趣的可以找我（Thankyou_baby）要一份。
试剂：这是大家最容易被欺骗的地方，认为试剂好Ct值就比较低，因为只有这个指标是最直观的，以至于市面上的公司都在拼命的降低Ct值，有的公司甚至以增加预热，预反应的方式，让Taq酶启动起来，先反应个几个循环。
在此，我跟大家讲讲试剂的内在本质。
1.Taq酶：一般来说，做qPCR所使用的Taq酶都是热启动的Taq酶，热启动的Taq酶分为两种，一种是化学修饰，一种是抗体修饰，很显然，抗体修饰的热启动酶更高级，生物学活动要比化学活动敏感得多，一旦到达反应温度，抗体修饰的热启动酶即可释放活性，而化学修饰有短暂的反应时间。所以，只要一个荧光定量PCR试剂盒的酶是抗体修饰的，那么大概率Ct值比化学修饰的要低。
两种热启动Taq示意图
化学修饰是上一个世纪的技术。但是化学修饰并不是一无是处，它能够保证酶活在反应过程中得到补充，特别是在最后的十几个循环。这就是为什么有的公司会添加两种酶。从某种意义上讲，它也是对抗体修饰酶活的不自信。如果一个酶能够持续反应到60个循环，添加候补酶就大可不必，就像一个足球运动员，如果它能够精神饱满的跑完90分钟，替补人员就没必要使用了。另外，如果抗体修饰的酶性能卓著，添加其他的酶反而是占用酶浓度。生产商肯定考虑过这个问题。
2.镁离子浓度：镁离子浓度是Taq酶活性的调节剂，合适的镁离子浓度能够促进Taq酶活性释放，浓度过低，会显著降低酶活性；浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。镁离子浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。镁离子离子的浓度一般控制在25mM，当然了，一个好的试剂盒，镁离子浓度一定是控制的比较好的。有的商家在试剂里面加入镁离子的螯合剂，可以达到镁离子浓度自动调节的作用。
3.Buffer：你看到的市面上大多数厂家的试剂盒的酶，可能都是同一厂家批量生产，然而其性能更卓越，主要是优化了Buffer，具体如何优化，我也不知道，反正你拿到产品也无法优化。
4.dNTP：主要考虑dNTP的纯度。这方面不得不说某些国外厂家专门生产dNTP，卖给中国的公司包装成试剂盒，你可以问问生产商dNTP的来源。纯度不够，抑制PCR反应。
试剂对Ct值影响主要是这几个方面。作为试剂的消费者，其实要考虑的不是Ct值，而是该试剂盒在低浓度模板和高浓度模板的情况下，是否会产生PCR抑制。从而使得标准曲线之间的距离不均衡。其实有个公司的产品是业界良心，一般生产商用中国制造贴美国品牌，而这个生产商用国外的高级原料包装成国产试剂，卖国产的价格，反向补贴，真是业界良心，为了避免种草，此处不公开说明。
样本浓度
首先我们说一般性原理：PCR通过Taq酶进行DNA合成，经过一个反应，扩增片段DNA的浓度翻一倍，也就是说每扩增N次，产物浓度就会变成2的N次方。
- 产物量Cn=起始模板量C1×2^循环数n
然而并不是每次都能100%的翻倍扩增，要不然为什么前面15个循环都在基线期呢？细思极恐。在扩增过程中造成的损失，我们用扩增效率（E）来表示，把2拆分成(1+E），通常，我们认为扩增效率与Taq酶有关，这其实是一个笼统的看法。我们都知道一个反应体系包含Taq酶，镁离子，buffer，dNTP，水，另外就是引物和模板，任何一个元素都可能影响扩增效率。
- 产物量Cn=起始模板量C1×（1+E）^循环数n
扩增效率E到底能有多少呢？如果是100%，那就是1，再好不过了，大多数能够做到95%~100%，这已经是很不错的扩增效率了。但是莫名其妙的是有的实验做到了110%，你可以用小脑袋瓜思考一下，DNA的半保留复制，一个复制循环竟然复制出多余2倍的DNA，怪了。很明显，引物二聚体可能在复制，非特异性扩增DNA可能也在复制，因为我们检测的是荧光值，只有多于目的片段的DNA在复制，才能可突破100%。
做一个已知样本量的标准曲线，倍比稀释模板，就会得到如下的结果。
模拟数据
- 标准曲线制作：利用Mean Ct （平均值）作图可得到标准曲线
- y = -3.29x + 40.33；纵坐标y就是Ct值，横坐标x就是样本浓度的数量级，3.29是斜率Slope，当扩增效率为100%时斜率为-3.32。
- R2 = 0.9978；相关系数Correlation coefficient (R^2) 表明标准曲线的线性，通常要求>0.98，越接近1，结果可信度越高。
- 斜率－�=10−1/斜率－1 ；越接近1越理想。
你也许会问，这些数据依据是如何得来的，为什么是这个公式，答：高中数学。咱们做生物学研究的，数学一般都不咋地，老一辈科学家都已经做出来了，你跟着公式计算没问题。
标准曲线
所以，回到我们的问题，除了最重要的样本浓度，仪器、耗材、试剂都会对Ct值造成影响。
Ct值对我们计算样本的拷贝数影响到底有多大呢？以下是在扩增效率完美达到100%的情况下和真实情况下的比较：
数字模拟
- 同样的扩增效率，Ct值少一个循环，拷贝数的数量级差别大概是0.3，也就是2倍左右；
- 同样的Ct值，扩增效率只要不是特别拉跨，拷贝数的数量级差别是0.01，也就是1倍左右；
- 当然这是理论计算，真实情况下扩增效率和Ct值相互影响；
结论：选择Ct值较低的产品是正确的，但是一定要避免非特异性扩增或者引物二聚体的情况。
解决方案
- 如果扩增效率比较高，Ct值降低是自然而然的事情；
- 如果遇到扩增效率大于1，要注意检查引物，它会不会产生二聚体，它的特异性如何，是不是要重新设计，因为扩增效率是根本；
- 扩增效率不高的主要原因有：热启动Taq酶活性不足、dNTP不纯、没有调校好Buffer、以及模板不纯，存在PCR扩增抑制，建议更换试剂盒
