Single-Cell Transcriptional Profiling Reveals Cellular Diversity and Intercommunication in the Mouse Heart
摘要：
心脏细胞组（形成心脏的细胞网络）的特征对于理解心脏发育和正常器官功能以及制定精确的治疗策略以对抗心脏病至关重要。最近的研究重塑了对心脏细胞组成的理解，并强调了非心肌细胞类型的重要功能作用。在这项研究中，作者使用scRNA-seq表征了小鼠非心肌细胞心脏细胞景观的单细胞转录谱，揭示了心脏细胞组的多样性，并促进了分离未研究的心脏细胞群（如壁细胞和胶质细胞）的技术发展。该研究还揭示了广泛的细胞间通讯网络，并表明心脏基因表达中普遍存在性别二型性。这项研究为哺乳动物心脏细胞组的结构和功能提供了见解，并为促进心脏细胞生物学研究提供了重要资源。
为了获得非肌细胞心脏细胞组的高分辨率图谱，从雌性和雄性小鼠的心室中制备了活的、代谢活性的、有核的非肌细胞的单细胞悬浮液，用于scRNA-seq分析。为了尽量减少由于酶消化和细胞分选而导致的转录谱的任何潜在变化，选择了一种解离培养时间相对较短的方案，并在所有后续步骤中保持细胞悬浮液在冰上（实验程序）。为了避免内皮细胞的过度采样，将内皮细胞的比例降低到占非肌细胞总数的10%（图1A）使用10x Chromium平台获得了单个细胞的转录谱，并分析了10519个通过质量控制和筛选的细胞，其中每个细胞平均测量了1897个基因。
为了基于共享和独特的基因表达模式识别不同的细胞群体，使用Seurat软件进行了降维和无监督细胞聚类。鉴定了12个表达主要细胞类型已知标记物的不同细胞簇（图1B和1C；包括内皮细胞（Cdh5，Pecam1），成纤维细胞（2簇；Cola1，Pdgfra，Tcf21），粒细胞（Ccr1，Csf3r，S100a9），淋巴细胞（3簇；Ms4a1、Cd3e、Klrb1c、Ncr1），周细胞（P2ry14、Pdgfrb），巨噬细胞（Adgre1、Fcgr1），树突状细胞（DC）样细胞（Cd209a），雪旺细胞（Plp1、Cnp），平滑肌细胞（SMC；Acta2，Tagln）。定义细胞群的原型标志物（图1C）包括Col1a1（成纤维细胞）、Ms4a1（B淋巴细胞）、Plp1（雪旺细胞）和Acta2（SMC）。还发现了其他基因并特别标记了每个主要细胞群（图1D）。每个主要聚类中表达受限的基因的GO富集分析支持细胞群的预测身份。例如，成纤维细胞的特异性由与细胞外基质相关的术语驱动；白细胞与免疫调节术语相关；髂内细胞和SMC与血管发育和稳态相关；雪旺细胞与神经调节因子有关。
为了揭示主要细胞类型的异质性，对这些群体进行了亚分群（图2A；图S1B和S1C）。使用了类似的无监督方法，如所述并分析单个类型或多个相关类型的细胞（例如髓系或淋巴系白细胞）以发现细胞亚型。对于一些细胞群，如内皮细胞、雪旺细胞和SMC，亚聚类没有识别出转录上不同的亚群（图2B），这表明这些细胞群在成熟心脏中相对均匀。相比之下，在其他细胞群体中出现了多水平的亚群异质性，其中亚群清晰而明显地分离了可识别的群体。例如，淋巴细胞群的亚群显示，第2组先天性淋巴细胞群（ILC2s；Artis和Spits）表达Gata3、Areg和Rora等基因，这些基因以前与T淋巴细胞聚集在一起（图1B、2A和2B）。此外，仅T淋巴细胞的进一步亚群产生了2个对应于CD4+和CD8+T细胞的群（图2A）。在一些主要的集群中，分化亚群的转录异质性反映了连续梯度，而不是具有明确基因表达边界的均质细胞的离散组。例如，将所有髓系群体一起进行亚聚类，确定了在整体水平上检测到的粒细胞群体（图1B和1C），但巨噬细胞和DC样亚型不太清楚地分离，并通过转录梯度连接（图2A–2C；图S2）。与基于标记物（如Cx3cr1、H2-Aa/Ab（主要组织相容性复合体[MHC]II类）、Ccr2、Mrc1和Adgre1）的心脏组织巨噬细胞的典型亚型相比，这呈现了更为细微的巨噬细胞转录景观图。根据几个基因组合表达的细微差异，至少可以将巨噬细胞分为五种亚型（图2A–2C），在某些情况下，在进一步的亚聚类后可以发现额外的髓系亚群。
在巨噬细胞中发现了一个细胞亚群，表现出巨噬细胞和成纤维细胞的杂交分子特征，类似于假定的纤维细胞群。这些细胞表达对应于成纤维细胞（Col1a1、Pdgfra和Tcf21）和巨噬细胞/白细胞（Fcgr1、Cd14和Ptprc）的中等水平的典型基因（图2D）。通过检测PDGFRaGFP/+小鼠心脏中的GFP+白细胞（图2E），并使用ImageStream细胞术捕获携带巨噬细胞表面标志物的GFP+单细胞图像（图2F），确认了假定纤维细胞的存在。还检测到在其他几个主要细胞群中表现出成纤维细胞样基因特征的小细胞亚群（图2G），这些亚群似乎是真实的。例如，观察到Icam2+内皮细胞显示成纤维细胞样基因表达，用表达Icam2的GFP+单细胞的细胞计数图像证实了这一点（图S3E）。杂交间充质表型的表达可能是广泛细胞类型的固有特征。
在本分析中确定的主要心脏细胞群中，已知心脏细胞群的显著缺失包括以Tbx18标记的心外膜细胞，其表达分散在成纤维细胞和壁细胞簇内的细胞中。标记推定心脏祖细胞的Isl1转录物存在于4个细胞中，但这些转录物分散在不同的心脏细胞群中，并没有形成明显的簇。表达Prox1和Pdpn的淋巴内皮细胞也不存在于人工减少的内皮细胞群中，但这些细胞通常只包括占非肌细胞总数的3%。也没有检测到离散的单核细胞群，这些单核细胞以低频率存在，很可能分散在巨噬细胞簇中。总的来说，这些细胞群的缺失可能是因为它们的丰度相对较低，并且缺乏高度独特的转录特征。
Cspg4和Mcam在壁细胞和雪旺细胞中表达，Pdgfrb在壁细胞及成纤维细胞中表达（图3A）。ITGA7染色后对常驻间充质细胞（RMC；图S3A）的检查使壁细胞能够使用mEF-SK4 作为次要标记物与成纤维细胞区分开来。该方法鉴定了3个群体：R1（mEF-SK4hiITGA7？），R2（mEF-SK4int/loITGA7+）和R3（mEF-SK4loITGA7？）（图3C）。对分别在成纤维细胞和壁细胞中标记表达的PDGFRaGFP和CSPG4-GFP小鼠的分析（图3B–D）表明，PDGFRaGFP/+小鼠心脏中几乎所有的GFP+RMC都在R1内，而CSPG4-GFP小鼠心脏中的几乎所有GFP+rmC都在R2内（图3D）。相反，对R1–3中GFP+细胞的分析表明，在PDGFRaGFP小鼠心脏中，几乎所有R1细胞都是GFP+，而在CSPG4-GFP小鼠中，大多数R2细胞都是GFP+（图3C）。因此，可以使用mEF-SK4和ITGA7标记物高精度地鉴定和分离心脏成纤维细胞（此处定义为PDGFRa+细胞），其中ITGA7将壁细胞与mEF-SK4低/点成纤维细胞区分开来。与ITGA7相似，发现MCAM将壁细胞与成纤维细胞分离，但也标记了雪旺细胞。此外，验证了ENTPD1, CD59a分别识别SMC和雪旺细胞（图S3C和S3D）。通过结合这些标记物，能够识别和分离SMC、周细胞和雪旺细胞（图3E和3F）。
在心脏非肌细胞中检测到同源受体的广播配体（图4A）确定成纤维细胞是与多种细胞类型紧密连接的最营养的细胞群（图4B）。其中包括支持特定心脏细胞群存活的信号电路（图4C）。例如，成纤维细胞和周细胞分别表达Csf1和Il34（图4D），它们通过CSF1R发出信号，是巨噬细胞生长和存活的重要因素。成纤维细胞还表达生长因子Ngf、Vegfa、Igf1、a n d Fgf2（图4C），它们支持自主神经系统、内皮细胞和壁细胞的神经元。
为了检测心脏细胞在心脏细胞组内支持细胞类型的能力，培养了混合的心脏细胞，并在体外观察了不同细胞群的生长。LysM-Cre:RosaZsGreen/+小鼠的非肌细胞培养物产生了大量由ZsGreen荧光蛋白标记的巨噬细胞（图4E和4F）以及内皮细胞（图4G）。然而，当用CSF1R阻断抗体、合成CSF1R抑制剂GW2580处理培养物时，或当在没有非巨噬细胞的正常生长培养基中培养时，巨噬细胞无法生长。尽管这些结果表明成纤维细胞支持心脏巨噬细胞和内皮细胞生长，但非成纤维细胞来源的必需生长因子表明了建立心脏生态位和支持常驻细胞群的细胞网络的复杂性。分析还表明，不同的细胞群支持心脏的神经支配。壁细胞表达Ngf和Ntf3，这两种都是轴突发育的重要因素（图4C）。心脏周细胞Ngf和Ntf3的表达突显了它们在心脏自主神经系统发育中的潜在重要作用。此外，心脏雪旺细胞（外周神经系统的髓鞘生成细胞）是一个离散的心脏细胞群。因此，多种心脏细胞类型有助于支持自主神经的发育、维持和信号转导。
为了调查心脏非肌细胞基因表达中的性别二型性，根据女性（Xist）和男性特异性基因的表达分离了女性和男性细胞（6个Y染色体基因：Ddx3y、Eif2s3y、Erdr1、Gm29650、Kdm5d和Uty；图5A）。在整体水平上观察到雌性和雄性细胞的高度相似的聚类模式，但在单个细胞类型中，发现了许多基因在表达中表现出性别二型性（图5A）。在女性细胞中上调的396个基因和男性中上调的430个基因中，绝大多数的差异表达低于2倍（图5B），女性和男性的中位差异为1.17倍。由于基于每种性别的2个生物复制的比较，分析能力不足，但这些发现提供了一个机会来表征转录网络中广泛的性别依赖性变化，并识别候选的性别二型基因。基因表达中的性二形性的具体机制可能多种多样，包括细胞亚型组成的细微变化以及对激素提示或反式性染色体因子的调节反应。对每个细胞群体中最高度的性二型基因的分析提供了证据，证明基因表达中性二型的程度和方向依赖于细胞类型（图5C；表S5）。此外，鉴定了27个基因，这些基因在细胞类型之间表现出不一致的性二型表达模式（图5D），揭示了生物性别对心脏基因表达的二分法效应。在男性巨噬细胞中，发现男性上调基因往往在对外来抗原的反应中发挥作用，GO显著富集，包括通过MHC II类分子的抗原处理和呈递，以及更广泛的免疫反应（调整后p<0.001）。相反，巨噬细胞中的雌性上调基因在涉及应激反应和电子传输链的过程中富集。心脏组织巨噬细胞转录谱中的性二形性，如男性上调Irf8，这与慢性炎症有关。相反，女性巨噬细胞中最上调的基因和两性巨噬细胞中最具性二态性的基因（图5C）是Tsc22d3（也称为Gilz），这是一种与抗炎功能有关的转录因子，也是糖皮质激素有效抗炎作用的下游驱动因素。Tsc22d3过表达会抑制炎症并减少心肌细胞死亡。然而，巨噬细胞Tsc22d3的表达不太可能单独赋予女性心脏抗炎表型，女性心脏也具有与抗炎机制有关的其他基因的表达升高，如Cebpb（图5C）。
这项研究建立在先前对心脏细胞多样性的探索基础上，并为心脏细胞组的结构和功能提供了独特见解，表征了小鼠心脏内主要非心肌细胞群的单细胞转录谱。观察到密集的配体受体网络促进了不同细胞类型之间的广泛沟通，并记录了生物性别对控制器官功能的转录程序的贡献。
使用scRNA-seq数据集开发了使用流式细胞术更精确地识别心脏壁细胞、成纤维细胞和雪旺细胞的策略。
总结的点：
1.识别了多种非心肌细胞的类型，并在淋巴细胞，巨噬细胞中分出了一些细胞亚群；在巨噬细胞中，有一种细胞亚群既有巨噬细胞的特征，也有成纤维细胞的特征。
2.使用mEF-SK4和ITGA7标记物高精度地鉴定和分离心脏成纤维细胞（此处定义为PDGFRa+细胞），其中ITGA7将壁细胞与mEF-SK4低/点成纤维细胞区分开来。
3.细胞通讯分析发现成纤维细胞是与多种细胞类型紧密连接的最营养的细胞群，其中包括支持特定心脏细胞群存活的信号电路。成纤维细胞还表达生长因子Ngf、Vegfa、Igf1、a n d Fgf2，它们支持自主神经系统、内皮细胞和壁细胞的神经元。