Gastroenterology：益生菌长双歧杆菌NCC3001能降低抑郁评分并改变大脑活动

背景与目的：益生菌可以减轻肠易激综合征（IBS）的症状，但其对精神疾病的影响知之甚少。我们进行了一项前瞻性研究，以评估长双歧杆菌NCC3001（BL）对IBS患者焦虑和抑郁的影响。

方法：我们在加拿大麦克马斯特大学，2011年3月至2014年5月对44名成年人进行了随机，双盲，安慰剂的对照研究。包括IBS症状和粪便模式（基于罗马III标准）和轻度至中度焦虑和/或抑郁评分（基于医院焦虑和抑郁量表）。在筛选被试时，评估临床病史和症状并收集血样。然后将患者随机分组并给予每日BL（n=22）或安慰剂（n=22）6周。在第0，6和10周，我们使用问卷确定患者的焦虑和抑郁水平，IBS症状，生活质量。在第0周和第6周，收集粪便，尿液和血液样品，并进行功能磁共振成像（fMRI）检查。我们评估了：大脑激活模式，粪便微生物群，尿液代谢组谱，炎症血清标志物，神经递质和神经营养因子水平。

结果：在第6周，BL组的14/22患者在医院焦虑和抑郁量表上的抑郁评分降低了2分或更多，而安慰剂组为7/22（P=0.04）。BL（长双歧杆菌NCC3001）治疗对焦虑或IBS（肠易激综合征）症状无显着影响。与安慰剂组相比，BL组患者的生活质量评分平均提高。功能磁共振成像分析显示，与安慰剂相比，BL减少了多个脑区（包括杏仁核和额边缘区域）对负面情绪刺激的反应。两组具有相似的粪便微生物群特征，炎症血清标志物，神经营养因子和神经递质水平，但BL组尿液中甲胺和芳香族氨基酸代谢物水平降低。在第10周，BL组相比安慰剂的患者的抑郁评分降低。

结论：在安慰剂对照试验中，我们发现益生菌BL可降低IBS患者的抑郁但不降低焦虑评分，并提高生活质量。这些改善与大脑激活模式的变化相关，表明这种益生菌降低了边缘反应性。本文发表在Gastroenterology杂志。

关键词：IBS，焦虑，抑郁，fMRI

背景

以腹痛和排便习惯改变为特征的肠易激综合征（IBS）影响了全球11%的人口，具有显着的社会经济影响，而目前的治疗效果却有限。其病理生理学尚不完全清楚，通常被认为是一种肠-脑相互作用障碍，常伴有精神疾病。

越来越多的证据表明，共生益生菌在IBS中发挥重要作用，因为多项研究表明，IBS患者肠道微生物群的组成或代谢活性异常。由急性细菌性胃肠炎影响微生物群的组成，抗生素或饮食因素引发的肠道菌群生态失调不仅可以引起IBS的胃肠症状，还可以促进其精神病并发症。此外，特定的益生菌已被证明可以改善IBS的胃肠道症状。我们之前已经证明，通过迷走神经依赖性途径，双歧杆菌NCC3001亚种长株（BL）的治疗使患有低程度肠道炎症的小鼠中的焦虑行为和海马脑源性神经营养因子（BDNF）水平正常化。

基于这些结果，我们假设BL将改善慢性肠道疾病患者的精神病并发症，因此我们在IBS患者中进行了一项初步研究。由于焦虑和抑郁在动物模型中很难区分，它们经常共存于患者体内，并且在两种情况下均呈现神经BDNF水平的改变，我们评估了BL对共病焦虑和抑郁的影响。次要指标是评估BL对IBS症状和生活质量的影响，并探讨脑激活模式，炎症标志物，神经递质，神经营养因子，肠道微生物群和尿液代谢物的变化，作为宿主-微生物代谢的标准。考虑到IBS的高异质性，我们决定将我们的研究限制在腹泻或混合模式的IBS患者中，因为他们似乎具有相似的神经-肌肉相互作用，并且与IBS便秘患者相比更可能出现低度肠道炎症和类似的微生物群。

虽然一些临床研究调查了健康个体中益生菌对行为和脑功能的影响，但我们的研究首次表明益生菌可以改善抑郁评分并改变焦虑抑郁症的IBS患者的大脑激活模式。

方法

研究概况

我们进行了一项随机，双盲，安慰剂对照实验。样本采集时间2011年3月至2014年5月。这项研究得到了汉密尔顿健康科学和圣约瑟夫的医疗保健研究伦理委员会，所有被试者都签署了知情同意书。

被试

我们根据的医院焦虑和抑郁（HAD）量表评分（HAD-a或HAD-a）招募了诊断为腹泻或混合型IBS和轻度至中度焦虑或抑郁评分的成人患者。排除了有器质性病变，免疫缺陷，腹部大手术，有其他精神病史，服用免疫抑制剂，糖皮质激素，阿片类药物，抗抑郁药或抗焦虑药，酒精或非法药物史的患者。洛哌丁胺和泻药被允许作为救援药物。在1个月的磨合期和试验期间禁止任何形式的其他益生菌。在磨合期和试验前3个月禁止使用抗生素。

研究设计

该研究涉及四次医院就诊（补充图1）。在筛查访视（-4周）时，评估临床病史和症状，并进行体格检查和全血检查。在基线时（第0周），重新评估纳入和排除标准和症状，收集粪便，尿液和血液样品，并进行fMRI研究。

补充图1：研究设计。

然后将患者随机分配喷雾干燥的BL（1.0E+10CFU/1克粉末与麦芽糖糊精）或含有1克麦芽糖糊精的安慰剂。产品在包装，颜色，味道和稠度方面难以区分。患者将小袋的内容物溶解在预热至20℃的100-200ml不含乳糖的牛奶，豆奶或米奶中。要求患者不要改变他们的饮食习惯或纤维摄入量。被试者记录治疗摄入量，第6周评估其症状，收集血液，尿液和粪便样本并进行功能磁共振成像检验。最后，在第10周随访中重新评估患者的症状。

除了定期就诊外，还应加拿大卫生部的要求，在治疗3周时对HAD评分进行了评估。在第一次随访时向患者提供了问卷，然后邮寄或电子邮件发给研究人员。

研究结果

主要结果是在6周时，减少HAD量表的焦虑和/或抑郁评分≥2。这是基于先前的分别为1.3和1.4的焦虑和抑郁评分的平均临床重要差异。次要结果包括焦虑和抑郁评分（HAD，连续数据）的改善，焦虑（状态特质焦虑量表，STAI），IBS总体缓解，IBS症状，躯体化，生活质量，大脑激活模式的改变（功能性磁共振成像，fMRI），血清炎症标志物，神经递质和BDNF，以及尿液代谢组学和粪便微生物群特征。

随机化分组

使用计算机程序（Proc Plan，SAS，V.9.1）产生随机化序列。根据性别和IBS状态（腹泻或混合大便模式）对随机分组进行分层。结果保存在分配给患者的密封不透明信封中。根据随机化序列为每组分配一个数字。在招募时，患者被分配到四个组之一，并给出该组的下一个随机数。对参与者和研究人员隐瞒了治疗分配。

治疗产品在包装，颜色，味道和一致性方面无法区分，只有制造商知道。

研究测量

通过HAD评分评估焦虑和抑郁。作为焦虑的另一个衡量标准，我们使用了STAI，它评估状态和焦虑。通过伯明翰IBS评分和布里斯托尔粪便量表评估IBS症状和体征。评估IBS症状的整体改善，患者将被问到一个有效的问题：“在过去的一周里，您的IBS症状有足够的缓解吗？”。健康相关生活质量（QoL）由SF-36测量，躯体化由PHQ-15问卷测量。

大脑活动通过功能性磁共振成像（fMRI）进行评估

Electric 3-Tesla Discovery MR 750，具有32个并行接收器通道的全身短孔扫描仪（通用电气，密尔沃基，威斯康星州）。1小时的方案包括7分钟的T1加权结构扫描，然后在四次fMRI血氧水平依赖扫描（BOLD EPI；TR/TE=2800）中重复四次可怕的面部后向掩蔽范式（补充图2）。使用Brain Voyager QX 2.8版完成MRI数据的预处理。检查解剖和功能数据，排除6个中任何一个头动大于5mm的功能磁共振成像扫描。解剖扫描转换为标准矢状方向，并进行空间归一化为标准Talaraich空间。对fMRI数据进行切片扫描时间校正和3D运动校正，并进行高斯滤波（FWHM=6毫米）。选择杏仁核作为感兴趣区域（ROI），最初来自WFUPick图谱，并根据全组平均变换到T1图像上的解剖标志进行配准。

补充图2：后向掩蔽实验范式。注视抖动，然后呈现恐惧或快乐的面孔67毫秒，然后用中性面孔掩蔽刺激83毫秒。参与者有1800毫秒的响应。收集了范式的四个，每个（扫描）进行84次试验。

禁食过夜后收集血液和尿液样本。处理后，将样品储存在-80℃直至检测。使用PAXgene血液RNA（PreAnalytiX，Qiagen BD，加拿大多伦多）收集BDNF样品。血清细胞因子和CRP水平分别通过人类促炎症7-Plex超敏感试剂盒（MSD，盖瑟斯堡，MD）和CRP套件（雅培实验室）检验。BDNF蛋白水平通过人BDNF DuoSet ELISA试剂盒（明尼苏达州明尼阿波利斯的R＆D Systems）检测。使用试剂盒定量血浆中神经递质5-HT。

使用配备有1.7mM探针的Bruker Avance II 600MHz光谱仪在300K（Bruker Biospin，Rheinstetten，Germany），使用具有抑制的标准脉冲序列，通过1H NMR分析评估尿液中的代谢物，并使用TOPSPIN软件包（版本2.1，Bruker，Germany）进行数据处理。使用内部数据库和2D 1H NMR光谱实验进行代谢物鉴定。使用软件包SIMCA-P+（版本14.0，Umetrics AB，Umeå，瑞典）和内部开发的MATLAB代码进行化学计量分析。采用正交投影到潜在结构OPLS判别分析（OPLS-DA）来研究代谢组学数据中的差异，这可以发现样品组之间的统计学差异。OPLS-DA的分类准确性是根据7次交叉验证周期中的预测样本确定的。为了突出显示模型中各个变量的权重，使用了变量重要性（VIP）指标，按照惯例，将大于1的值用作阈值。

使用Illumina测序16S rRNA基因的V3区进行微生物群分析。在治疗期结束时对粪便DNA提取物进行细菌菌株特异性PCR以检测BL的存在。

统计分析

使用IBM-SPSS（IBM-SPSS Statistics v20，Chicago，IL）进行统计分析。我们根据以前的动物模型数据进行了事后功效计算，结果显示这种益生菌具有很强的治疗潜力。我们估计每组19个样本量将使用两组χ2检验具有80%的功效，双侧显著性水平为0.05，假设安慰剂组中30%的抑郁和/或焦虑有所改善，而长双歧杆菌组为75%。

根据主要结果的意向治疗（ITT）原则分析来自所有随机受试者的数据。为了处理缺失的数据，我们使用极端病例分析假设所有缺失的受试者症状没有改善。按照方案评估（PP）排除了由于服用禁用药物或不遵守研究方案而未完成试验的被试数据，并用于主要和次要结果。为了测试对两个主要终点的影响，适当地使用Pearson卡方检验和Mann-Whitney U检验。此外，使用ANOVA重复测量在基线，治疗后第3,6和10周分析HAD评分。ANCOVA统计研究HAD抑郁评分的基线差异。使用双侧检验，p<0.05被认为具有统计学意义。通过一般线性模型（GLM）分析fMRI数据，其中实验任务事件与血液动力学响应函数卷积。构建脑区激活图，识别与实验条件（恐惧，快乐，注视）激活相关的活动峰值差异。BOLD信号对比进行随机效应分析，并使用fdr方法进行多重比较校正。二级随机效应GLM分析评估了治疗前后对恐惧面孔的群体反应差异。BL将调节杏仁核激活的先验预测用感兴趣区域（ROI）分析进行测试。将标准Brodmann图谱（WFU Pic Atlas）配准到平均T1解剖数据集中，并将右侧和左侧杏仁核作为感兴趣区域（ROI）。每个事件相关反卷积模型用于检查ROI内每个体素的BOLD信号变化。使用FDR（q）<.05并使用ROI平均统计值对聚类水平的多重比较进行对比校正。

对于代谢组学分析，将鉴定的代谢物的代表性信号整合并使用非参数Mann-Whitney检验进行测试。

结果

研究被试

60名患者参加了该研究（图1）。16名患者由于以下原因未能通过筛查：非常轻微的IBS症状（n=2）或HAD评分低（n=1）；使用抗生素（n=2）；不愿意遵守协议（n=7），或失访（n=4）。因此，44名患者被随机分配到两组（每个研究组22名），其中38名完成了研究（BL组n=18，安慰剂组n=20）。

图1被试筛选。

在治疗期间，6名患者因使用抗生素（n=4）或抗抑郁药（n=2）而剔除。基线特征组之间除了BL组的HAD-D评分较高，没有观察到差异（表1，表2）。

表1：研究被试的人口统计学特征。

人口统计学特征组间无显着差异（组间所有比较的P值>0.05）。

表2抑郁，焦虑，IBS症状，生活质量和躯体化评分

*与安慰剂相比p<0.05；

主要结果：改善抑郁和/或焦虑评分

在6周时，BL组22例（64%）患者中有14例抑郁评分降低（had-D）≥2分），而安慰剂组22例（32%）中有7例（相对危险度（RR）为1.98；95%置信区间（CI）1.16-3.38；ITT人群中p＝0.04）（表3A）。这种反应在PP分析中更为突出，BL组结果为78%，而安慰剂组结果为35%，抑郁评分较低（RR 2.4；95%CI 1.26-4.58；p=0.016）。在10周的随访中，对HAD-D评分进行ITT分析（RR 2.05；95%CI 1.07-3.93；p=0.04）和PP分析（RR 2.14；95%CI 1.11-4.12；p=0.04）。当仅对基线评分指示抑郁症（HAD-D≥8）的患者亚组中进行分析时，6周时的结果相似（RR 3.75；95%CI 0.6-22.1；p=0.047）。随访6周或10周，焦虑减少的患者（HAD-A≥2）数量两组没有显着差异。

表3：减少≥抑郁和焦虑2分在整个组（A）中在6周和10周时或在通过充分缓解IBS症状（B）分层时得分。

对两组指标进行的卡方检验。

为探讨抑郁评分与胃肠道症状之间的关系，敏感性分析显示，在报告IBS症状缓解的患者中，BL组对抑郁评分的有益作用在6周和10周时更可能发生（表3B）。

次要结果

HAD评分

治疗后，当评估为两组之间的连续结果时，HAD-D评分没有显着差异（表2），但当调整基线差异时，BL组有显著改善（ANCOVA p=0.049）。评估为连续结果的焦虑评分在两组之间相似（表2）。

IBS症状

在6周时ITT分析中IBS症状的充分缓解没有差异（RR 1.6，95%CI 0.86-2.91；p=0.22），但PP分析显示BL相对于安慰剂具有统计学显着益处（RR 2.03，95%CI 1.13-3.65；p=0.02）。然而，这种有益效果在10周的随访中并不显著（RR 0.70，95%CI 0.24-2.09；p=0.52）。在6周或10周时，伯明翰总体评分或便秘腹泻疼痛评分没有显着差异（表2）。

状态和特质焦虑与躯体化

在6周或10周随访期间，各组之间未观察到STAI评分的差异（表2）。在6周或10周的随访中，各组之间的躯体化评分也相似（表2）。

生活质量

与安慰剂组相比，BL组的物理子域QoL得到改善（p=0.03；95%CI 0.01-0.90）（表2），总体身体健康得到改善（p=0.04；95%CI 0.43-0.51）和工作或其他日常活动方面的问题（p=0.01；95%CI 0.009-0.013）。

功能磁共振成像的大脑激活模式

在所有研究对象中，大脑激活模式对恐惧和快乐面孔的反应不同（补充图3，补充表1）。在治疗前，对安慰剂组和BL组之间的恐惧刺激与固定的反应没有差异，除了后一组中视觉关联和顶叶皮质的更大参与（图2A-B）。

补充图3 组间对恐惧刺激与快乐或注视刺激的反应差异。

A、在两个时间点，全组对恐惧面部刺激的反应与全组对快乐面部刺激的反应形成对比。分析确定了一些大脑区域，这些区域表现出对恐惧刺激的激活提高，包括杏仁核，岛叶和额叶皮质区域。

B、全组对恐惧刺激的反应与全组对固定刺激的反应形成对比，在两个时间点显示广泛的激活，包括梭形回，丘脑，纹状体区域，顶叶皮质和海马/杏仁核复合体。

补充表1 在两个时间点响应恐惧与快乐刺激的全组反应。

图2功能磁共振成像的差异结果。

然而，治疗后，与安慰剂相比，BL组显示杏仁核，额叶和颞叶皮质的参与减少，以及枕骨区域对恐惧刺激的反应增强（与固定相比，图2B-C，表4）。总体而言，杏仁核参与度的变化与抑郁评分的变化相关（r＝0.52，p＝0.004，图2E）。在BL组中，杏仁核的参与减少与抑郁评分降低相关（r=0.58，p=0.03），但在安慰剂组中未观察到（r=0.20，p=0.46）。在BL组中，IBS症状充分缓解的患者比没有的患者杏仁核结果显著减少（RR 3.07，95%CI 0.89-10.59；p=0.03），但在对照组中未观察到（RR 1.5，95%CI 1.00-2.23；p=0.51；图2E）。比较恐惧和中立面孔的反应的结果没有显著区别。

表4：所有大脑区域（顶部）和杏仁核（底部）的大脑激活模式。

通过功能磁共振成像评估所有脑区（上）和感兴趣脑区-杏仁核分析（下）的治疗后组差异（安慰剂vs治疗；恐惧vs.固定）的脑激活模式。所有数据都经过多重比较校正；罗斯福（q）<.05。与BL组相比，阳性T值识别安慰剂组对恐惧刺激的更大激活区域。

炎症生物标志物，神经递质和BDNF水平

在6周时检验血清炎症标志物（CRP，TNF-α，IFN-γ，IL-1β，IL-6，IL-8，IL-10，IL12和IL-10/12比值）或神经递质（5-HT，物质P和CGRP）没有显著差异。同样，血液BDNF mRNA和BDNF蛋白水平也没有差异。补充表2 6周时的炎性细胞因子，BDNF和神经递质水平检测。

各个生物标志物的浓度单位是：CRP（mg/L），TNF-α，IFN-γ，IL-6，IL-8，IL-1β，IL-10（均为pg/mL），BDNF/β肌动蛋白Log10-5（拷贝/ng RNA），BDNF ELISA（ng/mL）CGRP（pg/mL），P物质（ng/mL），血清素（ng/mL）。

肠道微生物群组成

两组治疗前后的分类群，成分距离或α多样性（Shannon，Chao1和物种指数）没有显著差异。当通过Bray-Curtis原理坐标分析或BrayCurtis距离比较评估时，微生物群概况也相似（补充图4）。益生菌组18例（80%）患者中有15例在治疗结束时检测到BL。

补充图4：肠道微生物群分析。

尿代谢组学

使用一个预测和两个正交分量应用OPLS判别分析来模拟两组之间的尿代谢差异（补充图5）。该模型仅对治疗后分析具有统计学稳健性（R2X=0.17，R2Y=0.84，Q2Y=0.20，其中R2X：解释代谢组学数据（尿代谢物）的方差，R2Y：解释组方差（安慰剂和益生菌）和Q2Y：模型的稳健性）。治疗前，两组间无差异（Q2Y<0）。然而，治疗后，BL组显示苯乙酰谷氨酰胺（PAG），肌酸，4-甲酚硫酸盐和三甲胺-N-氧化物（TMAO）的尿排泄量降低（补充图5，表6）。治疗后BL组的4-甲酚硫酸盐水平与抑郁评分显著相关（r=-0.53，p=0.03），但对照组结果是不相关。代谢物与抑郁评分或杏仁核活性之间未发现其他相关性。

补充图5 1H NMR进行尿液代谢谱和多变量数据分析概述。

A：典型的1H NMR尿液代谢特征，具有选定的代谢物特征，以脂肪族（0.5–4.5 ppm）和芳香族光谱区域（6.5–9.0 ppm）突出显示。

B：用于尿NMR数据和组判别分析（上：安慰剂组，下：益生菌组）的OPLS-DA系数图概述。OPLS系数图使用反缩放变换和投影呈现，以进行生物标志物可视化。图中信号相对于零的方向表示与感兴趣的组的正或负协方差。每个变量用颜色绘制，该颜色指示从相关性矩阵计算的其辨别能力，从而突出显示富含生物标志物的区间。

表5：通过1 H NMR评估治疗6周后的尿代谢物。

代谢物数据报告为平均值（SD），具有来自1H NMR光谱峰面积的任意单位（au）。VIP：投影中的可变重要性；m：多重态；s：单线态。

不良事件

没有发现与研究的产品可能或有某种关系的严重不良事件（补充表3）。补充表3：最常见的不良事件。

NR：不相关，*由于使用抗生素而被排除。

讨论

在这项随机，安慰剂对照研究中，我们的主要结果是我们发现6周的长双歧杆菌NCC3001（BL）治疗降低抑郁评分但不降低焦虑评分，并且降低了涉及情绪处理的多个脑区（包括杏仁核和额-边缘区域）对恐惧刺激的反应。给予BL治疗的患者还显示出IBS的总体症状和QoL的物理领域的改善。尽管是一项受试者数量有限的试点研究，但这是第一项显示特定益生菌可改善IBS患者抑郁评分并诱导先前与抑郁症有关的区域大脑活动发生显着变化的试验，抗抑郁药治疗。事实上，抑郁症和焦虑症都与杏仁核激活过度有关，越来越多的证据表明了一种选择性的机制，5-羟色胺重吸收抑制剂（SSRIs）发挥其有益作用是通过下调其活性。我们的研究还验证了使用一些小鼠模型来筛选益生菌对人类的潜在治疗益处，因为BL治疗之前已显示可改善小鼠的焦虑行为和脑化学指标。

人们越来越关注肠道微生物群在健康和疾病中的作用。肠道细菌不仅指导和塑造宿主免疫系统，影响其新陈代谢，还影响肠道和中枢神经系统的功能。动物研究表明，微生物组成的变化或特定益生菌（包括双歧杆菌）加入可以改变宿主的行为和脑化学指标。这种微生物-大脑的通讯可能涉及多种机制，包括免疫，神经和代谢途径。我们之前已经广泛研究了BL对小鼠模型行为的有益作用，并表明这种益生菌影响炎症诱导的焦虑样行为和并使海马BDNF水平正常化。对行为的有益影响是通过迷走神经信号介导的，可能是通过释放能作用于肠神经元的神经活性代谢物。尽管越来越多的证据表明微生物群对动物模型行为的影响，但实验的数据相当有限。健康志愿者的两项研究报告益生菌对焦虑和抑郁评分没有重大影响。最近对重度抑郁症患者进行的一项初步研究显示，安慰剂组和益生菌组的抑郁症均有所改善，尽管后者的改善似乎更大。唯一将肠道微生物群与脑功能直接联系起来的研究评估了益生菌混合物对健康女性的影响。虽然在该试验中没有观察到行为改变，但功能磁共振成像显示边缘区和感觉脑区的BOLD活动减少，以响应面部表情，刺激情绪反应。我们使用了类似的情绪测试，已知在几个大脑区域诱导激活，包括杏仁核，对恐惧反应特别显著，因此被选为预定的ROI。我们发现，与安慰剂相比，BL给药减少了杏仁核和额-边缘复合体的激活，这导致了抑郁评分的降低。杏仁核不仅参与恐惧和焦虑的调节，还参与下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）的激活和内脏敏感性的调节。在我们的研究中，与安慰剂组相比，BL组的疼痛评分似乎有所改善，尽管差异无统计学意义。然而，BL组更有更多的IBS症状缓解，这与杏仁核激活减少有关。因此，疼痛感知的变化可以解释BL组IBS症状的总体改善现象，但这还需要在未来更好的试验中进一步研究。

多项研究已经证实了不同益生菌对IBS患者的有益作用，最近的一项荟萃分析显示双歧杆菌比乳酸杆菌更可能改善胃肠道症状。潜在的机制可能涉及改善IBS39患者亚组中存在的低度肠道炎症。炎症也与精神疾病有关，因为促炎细胞因子可以通过许多机制影响情绪，包括激活HPA轴和改变神经递质的代谢。我们发现安慰剂组和BL组患者的血清CRP或细胞因子水平没有差异，表明这种益生菌的有益作用不是由炎症改善介导的，与之前的小鼠研究一致。我们的小鼠研究表明海马BDNF被BL上调。神经营养因子BDNF影响神经元的生长和分化，功能性突触的形成和神经可塑性，并且在重度抑郁症患者中减少。我们发现与安慰剂组患者相比，给予BL的患者的血清中BDNF或神经递质水平（包括5-羟色胺）没有差异，但这并不排除特定脑区BDNF或中性神经递质水平受益生菌调节的可能性。

由于肠道微生物群组成的变化与行为和脑化学指标的改变有关，我们评估了治疗前后的粪便细菌分类谱。粪便16S rRNA基因测序分析表明，BL组的有益改善与微生物组成的主要改变无关。然而，BL组的尿代谢谱改变了，提示与甲胺和芳香族氨基酸降解的细菌下调，包括宿主细菌共代谢物4-甲酚硫酸盐（酪氨酸发酵的副产物）的减少。

有趣的是，已知4-甲酚硫酸盐能够抑制多巴胺β-羟化酶，多巴胺β-羟化酶是参与情绪调节的儿茶酚胺生物合成途径的组成部分。这种将多巴胺转化为去甲肾上腺素的酶在中枢和外周神经系统以及肾上腺髓质的嗜铬细胞中表达，其活性降低与抑郁症有关。在我们的研究中，4-甲酚硫酸盐水平与改善的抑郁评分相关。

BL组提示多巴胺/去甲肾上腺素途径可能在该益生菌的作用中起重要作用。在未来的研究中，有针对性的代谢组学方法应该能够进一步了解BL对芳香族氨基酸细菌代谢的影响以及下游对宿主儿茶酚胺产生的调节。

虽然这是第一个显示益生菌降低IBS患者抑郁评分的随机试验，但仍有一些重要的局限性需要强调。我们使用HAD量表来确定患有精神病合并症的患者，这在IBS的研究中得到了充分验证并被广泛用于筛查焦虑或抑郁。其心理测量特征可能不如临床医生管理的抑郁和焦虑评定量表，但其主要优点是它不用测量躯体症状，这是任何IBS患者研究中的一个强烈混杂因素。事实上，没有验证问卷可以用于并发内科疾病的患者。然而，为了证实我们目前的结果，需要在更大的患者队列中使用额外的特定心理测量方法进行验证性试验。我们研究的一个不足是安慰剂组中的两组基线抑郁评分的差较低异。益生菌组抑郁症的改善可能与平均回归或基线效应有关。然而，我们认为这是不太可能的，因为在调整基线差异时，以及仅在基线评分≥8指示抑郁症（HAD-D）的患者亚组中进行分析时，仍然存在BL组有益的统计学显着结果。此外，BL组HAD评分的抑郁分量表与安慰剂HAD评分无显着差异（补充图6）。此外，观察到的BL组情绪调节相关脑区的激活模式的变化支持了这种益生菌具有抗抑郁特性的观点。我们没有发现BL对个体肠道症状的任何影响，但我们的研究没有足够的能力来检测这些变化。因此，在BL用于临床实践中之前，需要对IBS和合并抑郁症患者进行更大规模，适当的试验，以验证我们关于精神病和肠道症状的数据。

补充图6:HAD-D和HAD-A的估计边际均值差异（ANOVA多次检验）。

总之，长双歧杆菌NC3001对轻度至中度合并症抑郁症具有长期的有益作用，并暂时改善IBS和QoL的总体症状。这与情绪加工相关的多个大脑区域的活动变化有关，但个体肠道症状没有改善，表明这种益生菌的中枢作用可能是通过调节宿主儿茶酚胺产生的治疗效果的基础。

补充方法

微生物分析：

如前所述，使用Illumina测序16S rRNA基因的V3区进行微生物群分析。数据由内部生物信息学管道处理，该管道包含质量过滤，Cutadapt，PandaSeq，AbundantOTU，mothur和QIIME。丰富度的OTU提供按照分类单位（OTU）中聚类序列的输出。

分类聚类使用RDP分类器和Greengenes训练集。分析包括每个样本的α多样性度量和使用QIIME的总多样性估计，以及β多样性指标（加权和未加权Unifrac，Bray Curtis），并使用QIIME和R中使用PhyloSeq软件包的其他统计分析。

代谢组学分析：

1H NMR代谢物分析方法应用于尿液样本，这种样本由个体近期稳态代谢史的有用时间平均值表示，并且还通过对微生物-哺乳动物共代谢物（补充图5A）的代谢模式分析关于肠道微生物代谢活动的间接信息。

将40μL尿液与20μL含有1mM 3-三甲基甲硅烷基-[2,2,3,3-2H4]-1-丙酸钠（TSP，化学位移）的氘代磷酸盐缓冲溶液0.6M KH2PO4混合物，参考δH=0.0ppm）。将60μL混合物转移到1.7mm NMR管中。使用配备有1.7mm探针的Bruker Avance II 600MHz光谱仪（Bruker Biospin，Rheinstetten，Germany）在300K进行检测，使用具有水抑制的标准脉冲序列获得1 H NMR光谱，并使用TOPSPIN（版本2.1，Bruker，德国）软件包分析。使用内部数据库和2D 1H NMR光谱实验对尿液代谢物进行鉴定。

使用软件包SIMCA-P+（版本14 Umetrics AB，Umeå，瑞典）和内部开发的MATLAB代码进行化学计量学分析。对潜在结构（OPLS）和OPLS判别分析（OPLS-DA）的正交投影应用于探索代谢组学数据中的方差，用以解释样品组之间的统计学差异。OPLS-DA的分类准确性是根据7倍交叉验证周期中的预测样本确定的。为了突出显示模型中各个变量的权重，使用了投影中的变量重要性（VIP），按照惯例，将大于1的值用作阈值。此外，根据先前的方法，使用可变系数识别与组分离相关的NMR变量。使用非参数检验对鉴定出的代谢物的代表性信号进行整合和曼-惠特尼检验。