宏基因组实战4.基因注释Prokka
前情提要
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- 宏基因组分析理论教程
- 微生物组入门圣经+宏基因组分析实操课程
- 1背景知识-Shell入门与本地blast实战
- 2数据质控fastqc, Trimmomatic, MultiQC, khmer
- 3组装拼接MEGAHIT和评估quast
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Prokka注释基因
Annotation with Prokka https://2017-cicese-metagenomics.readthedocs.io/en/latest/prokka_tutorial.html
Prokka简介
细菌基因组、宏基因组的基因注释一直是一个非常复杂的问题，Prokka的出现改变了这一切。
Prokka: rapid prokaryotic genome annotation，快速的原核基因组注释。就是上面的神兽，猜猜是什么动物，但真不是皮卡丘。
Prokka是一个命令行软件工具，可以在一台典型台式机上在约10分钟内充分注释一个细菌基因组草图。它产生标准兼容的输出文件以进行进一步分析或者在基因组浏览器中查看。Prokka是用Perl实现的，在遵循开源GPLv2许可证下可以从 http://www.vicbioinformatics.com/software.prokka.shtml 免费获得。
此软件2014年发表于Bioinformatics，截止2017年11月2日Google学术统计引用1265次，最新版本1.12于2017年3月14日更新，大小360MB。因为它是一个复杂的分析流程，依赖关系众多。
安装程序
进入工作目录，即你下载数据的目录
# 设置工作目录 wd，用户根据自己的实际情修改
wd=~/test/metagenome17
cd $wd
# 下载prokka
git clone https://github.com/tseemann/prokka.git
# 安装依赖关系
sudo apt-get -y install bioperl libdatetime-perl libxml-simple-perl libdigest-md5-perl
# 安装perl包XML
sudo bash
export PERL_MM_USE_DEFAULT=1
export PERL_EXTUTILS_AUTOINSTALL="--defaultdeps"
perl -MCPAN -e 'install "XML::Simple"'
exit添加环境变量和设置数据库
# 添加环境变量
export PATH=$PATH:`pwd`/prokka/bin
# 自动搜索并添加数据库
prokka --setupdb
# 测序数据库
prokka --listdbProkka使用Uniprot-DB数据库，可使用–usegenus –genus Enterococcus指定额外的数据库
运行Prokka注释contig
# 建立工作目录
mkdir annotation
cd annotation
# 准备输入文件
ln -fs ../assembly/combined/final.contigs.fa ./
# 一句命令10分钟搞定之前别人半年的工作
prokka final.contigs.fa --outdir prokka_annotation --prefix metagG --metagenome --kingdom Bacteria
就是这么简单，一句命令10分钟搞定之前别人半年的工作。给你输出了你想要的，不想要的各种格式结果。
输出文件说明详见下面链接 https://github.com/tseemann/prokka/blob/master/README.md#output-files
下表我列出各种输出结果格式简介
表1. Prokka 结果说明
| Extension | Description |
|---|---|
| .gff | 基因注释文件，包括gff和序列，可用igv直接查看 |
| .gbk | Genebank格式，来自gff |
| .fna | 输入contig核酸文件 |
| .faa | 翻译CDS的AA序列 |
| .ffn | 所有转录本核酸序列 |
| .sqn | 用于提交的序列 |
| .fsa | 输入序列，但有sqn的描述，用于tbl2asn生成sqn文件 |
| .tbl | 特征表，用于tbl2asn生成sqn文件 |
| .err | 错误报告 |
| .log | 日志 |
| .txt | 统计结果 |
| .tsv | 所有注释基因特征表格 |
查看结果
# 进入结果目录
cd prokka_annotation
# 结果总结
cat metagG.txt
organism: Genus species strain
contigs: 7904
bases: 13222363
CDS: 12199
tmRNA: 4
tRNA: 300
repeat_region: 7上面我们看到结果统计的叠连群(contigs)数量，预测基因(CDS)数量等基本信息。下面看一下预测的基因序列。
预测基因展示：
# 查看序列的基因序列
less -S metagG.fsa
>k141_4 [gcode=11] [organism=Genus species] [strain=strain]
ATCGTTTCCCTGCAGACGTCCACCGAGACGAGGTCCGTGGCTTCCACCAGTGCCCCGAGG
GCTACGATGTTGGCCACCTTTTCGCTGCCAAGTTCAAGCGCCGTGGTATGACACGGCACC
GGCAGCACGATGATATCGGATCTGGGGTCGGGATAATCCAGCAGGTCGGAATTGTAAATC
AGCGCTCCGCCCGGTTTTATGATACCGATGAAT
>k141_6 [gcode=11] [organism=Genus species] [strain=strain]
ACAGAACAACCAGGTGGAAACGTATGGTAATTATTGACACGAACACCCACGCCTTGTATT
ATAAGCGTCGCCCCTTGAAACGGGCGGCGTTTTTCATGCACCTTGACAGAGTTATATAGG
CAGGAGAGTAAGCGGGAGAAGGTAAGAGCGATTTATGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGA
CGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTCTG结果众多，不再一一列举，下面用到自然会提到并介绍，用不到的我也不懂了，今天就到这里了。
Reference
- 教程原文 https://2017-cicese-metagenomics.readthedocs.io/en/latest/prokka_tutorial.html
- Prokka: rapid prokaryotic genome annotation https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24642063
- Prokka中文摘要 http://www.chinapubmed.net/24642063
- Prokka官网 http://www.vicbioinformatics.com/software.prokka.shtml
- Seemann T. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics. 2014 Jul 15;30(14):2068-9. PMID:24642063
- 官方帮助 https://github.com/tseemann/prokka/blob/master/README.md
写在后面
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