Tn5-DNAseq Library Prep Kit
AT4101-01/02/03 使用说明书
产品简介
Tn5-DNAseq Library Prep Kit是针对illumina测序平台开发的DNA文库构建试剂盒。试剂盒极大的简化了DNA小片段文库构建过程，使用一步简单的酶促反应替代了传统DNA文库构建过程中的片段化、末端修复以及接头连接反应等步骤，显著缩短了文库构建的时间。仅需2.5h即可将5ng/50ng DNA构建成高质量的DNA文库。试剂盒操作简单，极大的避免了繁杂操作带来的误差，构建的文库均一性高。
试剂盒组成
产品成分AT4101-01
（6次）
AT4101-02
（24次）
AT4101-03（96次）保存条件
Tn5-Frag Buffer24 uL96 uL384 uL-20℃
TnZ24 uL96 uL384 uL-20℃
Stop Solution120 uL480 uL1920 uL4℃
Tn5-PCR Buffer60 uL240 uL960 uL-20℃
dNTP(2.5 mM)25 uL100 uL400 uL-20℃
Tn5-Universal Primer6 uL24 uL96 uL-20℃
Tn5-PCR Enzyme1.5 uL5 uL20 uL-20℃
注意事项
[if !supportLists]1. [endif]试验前请仔细阅读本说明书，注意每个组分的保存温度，确保实验顺利完成。
[if !supportLists]2. [endif]操作过程请注意避免核酸样品和产物之间的交叉污染。
[if !supportLists]3. [endif]请使用不含RNA酶或DNA酶的枪头、EP管进行试验。
[if !supportLists]4. [endif]DNA浓度需使用Qubit测定，起始DNA量测定不准确，会影响文库得率；
[if !supportLists]5. [endif]实验所用磁珠应提前30分钟自4℃环境中取出，平衡至室温。所有磁珠操作均需置于室温。
[if !supportLists]6. [endif]Stop Solution在使用前，请确保其回复室温，如有沉淀析出，请放置37℃加热混匀，使沉淀溶解。
[if !supportLists]7. [endif]80%乙醇需现配现用，用其清洗磁珠后，需清除干净，避免对后续反应产生影响。
需自备试剂和耗材
无水乙醇；NF-H2O；ATPure Plus beads（DNA片段分选纯化磁珠）或效果相同的纯化磁珠
200uL PCR管；1.5mL离心管；磁力架；
实验原理图
操作步骤
[if !supportLists]一， [endif]样本片段化反应：
1.在新的PCR管中配制如下反应体系：
DNA样品(5ng/50ng)X uL
Tn5-Frag Buffer4.0 uL
TnZ*4.0 uL
NF-H2O(12-X) uL
总体积20.0 uL
* TnZ在使用时，请先使用移液器轻轻吹打，混合均匀，然后每个样本单独加入，切勿配置混合液
移液器轻轻吹打20次充分混匀，55°C反应15分钟；
反应结束后加入20uL Stop Solution并且充分混匀；
2. 用磁珠纯化片段化产物，步骤如下：
[if !supportLists]1） [endif]将室温放置的30min后的ATPure Plus beads涡旋震荡混匀，并吸取40 uL至40 uL片段化产物中，移液器轻轻吹打10次充分混匀，转移混和样本至新的1.5 mL离心管中，室温孵育5分钟。
[if !supportLists]2） [endif]将反应管短暂离心并置于磁力架上，放置5min，待溶液澄清，移除上清。
[if !supportLists]3） [endif]保持离心管始终处于磁力架中，加入200 uL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒后移除上清。
[if !supportLists]4） [endif]重复步骤3，总计漂洗两次。
[if !supportLists]5） [endif]保持离心管始终处于磁力架中，开盖干燥5min。
[if !supportLists]6） [endif]将离心管从磁力架中取出，加入35uL NF-H2O洗脱。涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀。
[if !supportLists]7） [endif]将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清吸取33.8uL上清至200uLPCR管中，待用。
[if !supportLists]二， [endif]PCR扩增：
在新的PCR管中配制如下反应：
Recovered DNA Fragment33.8 uL
Tn5-PCR Buffer10.0 uL
dNTP(2.5 mM)4.0 uL
Tn5-Universal Primer1.0 uL
Tn5-Primer8 Index N*1.0 uL
Tn5-PCR Enzyme0.2 uL
总体积50.0 uL
*Tn5-DNAseq Library Index kit提供多种index，可根据样本数量选购。
充分混匀后在PCR仪中，进行如下反应：
温度时间循环数
72℃3min
95℃30s
95℃15s
n* Cycles
60℃30s
72℃3min
72℃5min
4℃∞
*样本起始量为5ng时，扩增反应的循环数为12
样本起始量为50ng时，扩增反应的循环数为9
反应结束后取出，进行片段筛选。
[if !supportLists]三， [endif]文库片段大小筛选：
文库片段大小筛选采用两轮磁珠捕获操作，磁珠用量需根据目标文库片段大小调整，具体用量请参看表一：
[if !supportLists]1） [endif]使用NF-H2O将PCR产物补足至50uL。
（因PCR反应中会使反应体系发生变化，此步骤非常重要，体积不准确会导致筛选后的片段长度范围有偏差）。
[if !supportLists]2） [endif]将室温放置30min后的ATPure Plus beads涡旋震荡混匀，吸取R1体积的ATPure Plus beads和50uL PCR产物，加入1.5mL 离心管中，移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温放置5min；
[if !supportLists]3） [endif]将1.5mL离心管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，室温放置10min，待溶液澄清转移上清至干净1.5mL 离心管中，丢弃磁珠；
[if !supportLists]4） [endif]向上清中加入R2体积的ATPure Plus beads，移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育10min；
[if !supportLists]5） [endif]将1.5mL离心管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，室温放置5min，待溶液澄清移除上清；
[if !supportLists]6） [endif]保持1.5mL离心管始终处于磁力架中，加入200uL 80% 乙醇（现用现配）漂洗磁珠，室温孵育30s后移除上清；
[if !supportLists]7） [endif]重复步骤6，总计漂洗两次；
[if !supportLists]8） [endif]保持1.5mL离心管始终处于磁力架上，开盖空气干燥磁珠5min；将EP管从磁力架中取出，加入22uL NF-H2O洗脱，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀；
[if !supportLists]9） [endif]将EP管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清，吸取20uL上清至干净的0.2mL PCR管中；
表一
文库平均总长度~350 bp~450 bp~550 bp
文库平均插入长度~230 bp~330 bp~430 bp
文库总长度分布范围250~450 bp300~700 bp400~900 bp
第一轮磁珠用量R1=35uLR1=30uLR1=25uL
第二轮磁珠用量R2=7.5uLR2=7.5uLR2=7.5uL
[if !supportLists]四， [endif]文库质检
文库质检分为两方面，定性检测和定量检测
文库的定性检测，推荐使用凝胶电泳或者Agilent生物分析仪等方案对文库进行检测；文库的定量检测，推荐使用Realtime PCR对文库进行检测。
文库结构
Tn5-DNAseq Library Prep Kit的文库结构如下：
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-nnnnnnn-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACXXXXXXXXATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
注：nnnnnnn 为插入序列
XXXXXXXX为index序列
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