一、立项依据
近年来，随着人口老龄化和生活方式的改变，结直肠癌发病率明显上升。目前全球范围内，结直肠癌是最常见的三大肿瘤之一。根据世界卫生组织的一项调查研究报告，中国结直肠癌的发病率和死亡率在所有恶性肿瘤中均排在前五位。而xx结直肠癌在所有恶性肿瘤中占比高达10.45%，仅次于肺癌，成为恶性肿瘤所致经济、社会负担的重要源头。
目前结直肠癌的主要治疗手段包括手术切除、放化疗治疗，以及新一类免疫抗癌疗法等，虽然这一系列治疗方法有效延长了部分患者的生存时间，结直肠癌的5年生存率仍然较低。大量研究表明肿瘤干细胞是导致肿瘤患者术后复发、放化疗不敏感、免疫治疗抵抗等的核心因素。
肿瘤干细胞存在于特定肿瘤组织微环境中，通过非对称分裂一方面促进肿瘤生长，另一方面维持自己的干细胞特性，为肿瘤的持续增长提供后备力量。除此之外，肿瘤干细胞被认为在肿瘤初始阶段获得重要癌基因或抑癌基因的突变，从而成为肿瘤发生发展中的“先头兵”，自身增殖失控的同时，重塑组织微环境，使其更利于其他肿瘤细胞的存活。在肿瘤转移过程中，肿瘤干细胞也发挥了必不可少的作用，研究发现肿瘤干细胞经循环系统进入转移组织时，同样可以定植并塑造合适的肿瘤微环境，促进转移灶的形成。由此可见，肿瘤干细胞在很大程度上决定了肿瘤发生发展的进程。
更重要的是，在肿瘤治疗过程中，肿瘤干细胞表现出对化学药物和放射治疗的高度不敏感。研究发现结直肠肿瘤干细胞对5-氟尿嘧啶和奥沙利铂等直肠癌一线化疗药物存在固有性药物抵抗。此外，肿瘤干细胞理论认为其大部分处于静息状态，而放疗和化疗等肿瘤治疗手段都是针对于正在增殖的肿瘤细胞。因此，在很多结直肠癌患者中，虽然用药初期可以达到很好的治疗效果，但之后会很快耐药，并呈现雪崩式多药耐药和肿瘤迅速进展。这一现象的机制可能是由于化疗药物在杀伤增殖的肿瘤细胞时，并不能作用于肿瘤干细胞，这种筛选压力为肿瘤干细胞创造了竞争优势，从而使肿瘤干细胞及其衍生细胞成为后期肿瘤的主体，加剧肿瘤耐药和恶化。另一方面，肿瘤手术切除或放化疗无法保证清除所有的肿瘤干细胞，而极少量的肿瘤干细胞即可成瘤。因此，肿瘤干细胞是肿瘤治疗中耐药，以及治疗后复发的重要原因。
综上所述，以肿瘤干细胞作为结直肠癌治疗靶点，将成为解决结直肠癌疗效不理想的重大突破点。但由于缺乏特异性标志物，目前对结直肠肿瘤干细胞的研究仍存在很大争议。因此，依托×××医院丰富的结直肠癌临床诊疗资源，结合最新的大肠肿瘤类器官培养、crispr cas9基因编辑技术、条件性基因修饰小鼠和体内示踪体系等多个技术平台，立足于现有对结直肠肿瘤干细胞认识的基础，发现新的肿瘤干细胞标志物，并利用特异性抗体或小分子抑制剂达到靶向杀伤肿瘤干细胞的效果，再联合传统放化疗及免疫疗法，提出结直肠癌治疗新方案，实现结直肠癌的完全治愈。
二、国内外研究现状和发展趋势
肿瘤异质性学说自1984年被Gloria H. Heppner提出以来，已经成为肿瘤研究领域的基本共识。肿瘤组织中除了肿瘤细胞外，还包括多种基质细胞、免疫细胞、血管内皮细胞等多种细胞组分，这些细胞与肿瘤基质一起，构成复杂的肿瘤微环境。而在肿瘤发生的初始阶段，肿瘤微环境尚未形成，仅由少量细胞累积突变，转变成增殖失控、并具有自我维持和分化能力的肿瘤干细胞，进一步与其周围环境相互作用，经过上皮间质化、免疫细胞募集、血管浸润等过程，完成从正常组织向肿瘤组织的转变。虽然从理论上肿瘤干细胞即为肿瘤初始细胞，但由于正常细胞向肿瘤细胞的转化过程难以监测，目前对肿瘤干细胞的存在功能还存在争议。
肿瘤干细胞在体内的识别依赖于其特异性标志物，不同肿瘤中干细胞既有共性也有区别。如在包括结直肠癌、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤中均检测到CD133+的肿瘤干细胞，而Lgr5+肿瘤干细胞仅存在于肠道肿瘤中。近年来，表达不同标记分子的结直肠肿瘤干细胞亚群被发现，其中包括CD133、CD44、CD166、ALDH1、CD29、CD24、ESA和Lgr5等，研究发现这些分子标记的单个细胞形成的克隆均可成瘤。但这些分子一方面并非完全特异，许多正常细胞也有阳性表达；另一方面，阳性肿瘤干细胞群之间是否有重叠，以及这些细胞的功能是否一致或相互影响，有无更特异或广谱的标志分子可以特异性标记并且囊括结直肠癌中所有肿瘤干细胞尚无定论。
肿瘤干细胞在多种生物学特性上表现出有别于其他肿瘤细胞的特征，如自我更新、独立成瘤、对放疗和化疗药物不敏感、对免疫治疗抵抗等，越来越多的研究开始着眼于赋予肿瘤干细胞这些生存优势的分子机制。Dick JE实验室发现单个人CD133+直肠癌细胞就能在免疫缺陷小鼠体内形成肿瘤。进一步研究表明，结直肠肿瘤干细胞在细胞周期、分化成熟、上皮间质变等过程的调控与肿瘤细胞相差甚大，尤其对肠道干细胞维持起至关重要作用的Wnt信号通路及TGFβ下游信号异常激活，促进肿瘤干细胞的存活和干性维持。
针对结直肠肿瘤干细胞独特的生物学特性靶向肿瘤干细胞，为放化疗治疗不敏感及肿瘤复发提供了新的治疗思路。利用维甲酸诱导恶性增殖细胞成熟分化在临床治疗早幼粒细胞白血病已获得巨大成功，说明诱导低分化的肿瘤干细胞成熟分化，抑制其增殖能力，将提高肿瘤治疗效果。细胞和动物水平实验发现，端粒酶抑制剂通过干扰肿瘤干细胞的细胞周期，从而实现对肿瘤干细胞增殖失控的下调，进一步研究发现阻断细胞周期还能提高肿瘤对化疗药物的敏感性。TGFβ作为细胞上皮间质化的重要调控因子，其功能异常在超过一半的结直肠肿瘤组织中可检测到，肿瘤细胞TGFβ功能异常会促使其向肿瘤干细胞样表型转化。临床研究发现TGFβ下游信号分子Kindlin‑1的表达水平与疾病预后呈负相关，因此，阻断TGFβ信号传导，减少肿瘤细胞干性转化，也是目前结直肠肿瘤治疗的研究热点。而Wnt作为维持肠道微环境平衡的重要信号，在结直肠癌中异常率高达70%以上。Wnt通路中APC或β-catenin突变使其持续激活，是肿瘤干细胞无限增殖的重要分子机制。临床前研究发现Wnt信号通路拮抗剂可有效控制肿瘤生长，进一步临床Ⅰ/Ⅱ期实验也发现这一治疗策略的安全性和有效性。
利用肿瘤干细胞高增殖、低分化、累积突变多等特点，在传统治疗基础上外加针对肿瘤干细胞的靶向疗法，目前已取得一定的进展。但由于一方面肿瘤干细胞缺乏特异性标志物，无法精确定位杀伤，降低了治疗效果；另一方面，目前关注的肿瘤干细胞生物学过程过于基础，系统性药物干扰会严重影响正常细胞功能，增加药物副作用。因此，为攻克结直肠癌死亡率高的难题，降低结直肠癌的社会经济负担，发现更加特异的肿瘤干细胞标志物，找到精准清除肿瘤干细胞的特异性抗体或小分子药物，联合传统化放疗和免疫疗法，提出结直肠癌治疗新方案迫在眉睫。
三、拟解决的关键科学问题和主要研究内容
拟解决的关键科学问题：
1. 多药耐药及进展迅速的结直肠癌患者中肿瘤干细胞类群鉴定和组织分布；
2. 结直肠肿瘤干细胞在疾病发展及耐药中的功能；
3. 针对结直肠肿瘤干细胞的生物学特性特异杀伤肿瘤。
主要研究内容：
1. 根据肿瘤进展情况和药物敏感性比较分析结直肠癌临床样本组织，筛选可能的肿瘤干细胞类群。
2. 明确肿瘤干细胞干性及其耐药特性的分子机制；
3. 探索基于肿瘤干细胞独特生物学特性的结直肠癌治疗靶点；
4. 联合肿瘤干细胞靶点治疗与传统放化疗或免疫疗法，提出结直肠癌治疗新策略。
详细研究内容：
本项目立足于×××医院丰富的结直肠癌临床诊疗资源，从临床样本出发，根据患者疾病进展水平和对药物的敏感性，比较分析进展迅速且多药耐药患者肿瘤组织与药物敏感或进展缓慢，以及良性或正常组织的基因表达水平，结合基因功能分析，筛选出可能作为肿瘤干细胞新标记分子的基因，并明确其组织分布情况。进一步在细胞水平和类组织水平分析筛选出的阳性细胞对肿瘤生长及药物敏感性的影响，并利用特异性抗体或小分子化合物精准杀伤肿瘤干细胞。通过体内示踪体系和条件性敲除小鼠平台验证这群细胞在肿瘤发生发展中的重要作用，联合肿瘤干细胞靶向治疗和传统放化疗或免疫疗法，明确肿瘤干细胞靶向疗法的加成作用。最后，利用结直肠癌患者组织细胞，体外验证联合治疗对肿瘤的杀伤作用，对肿瘤进展迅猛及多药耐药患者开展临床试验，评估治疗方案的安全性和有效性。
1. 根据肿瘤进展情况和药物敏感性比较分析结直肠癌临床样本组织，筛选可能的肿瘤干细胞类群。监测结直肠癌患者肿瘤进展情况，根据患者对药物的敏感性，重点收集肿瘤进展迅速、多药耐药患者肿瘤组织，通过测序比较分析这些患者组织与进展缓慢或药物高度敏感，及良性或正常组织的差异表达基因，并挑选出与干性及耐药相关的基因，作为肿瘤干细胞标志分子待选（暂名基因ABC）。利用免疫组织化学或荧光染色，在患者肿瘤组织中定位阳性细胞群，同时与目前已知的肿瘤干细胞标志分子共染，明确其标记细胞的类群分布和独特性。
2. 明确肿瘤干细胞干性及其耐药特性的分子机制。检测不同结直肠癌细胞系基因ABC的表达水平，观察这些基因的表达是否影响肿瘤细胞生长速度和对化疗药物的敏感性。在肿瘤细胞系上过表达或敲低基因ABC，观察其对肿瘤细胞干性、药物敏感性等生物学特性的影响。利用该基因产物特异性抗体或小分子抑制剂处理不同表达水平的肿瘤细胞，同时监测其对药物的敏感性，明确肿瘤干细胞靶向治疗的可能性。通过单细胞成瘤实验确定基因ABC阳性细胞肿瘤干细胞的特性，并根据基因ABC的功能阻断实验确认其对肿瘤干细胞干性维持的分子机制。
3. 探索基于肿瘤干细胞独特生物学特性的结直肠癌治疗靶点。在细胞水平实验结果的基础上，结合最新结直肠癌类器官体外培养技术，利用crispr cas9敲除或致突变基因ABC，观察基因ABC对肿瘤类器官生长的影响，进一步评估肿瘤干细胞靶向治疗与放化疗药物共同作用对类器官的影响。同时构建基因ABC体内示踪和关键调控因子条件性敲除小鼠，建立自发结直肠癌肿瘤模型，在体评价基因ABC对肿瘤干细胞的标记能力，及其对肿瘤发生发展和药物敏感性的影响。
4. 联合肿瘤干细胞靶点治疗与传统放化疗或免疫疗法，提出结直肠癌治疗新策略。基于细胞、类器官和动物实验的有效性和稳定性，利用肿瘤进展迅速且多药耐药结直肠癌患者组织及分离得到的细胞，体外培养体系中在传统放化疗或免疫治疗方案的基础上引入肿瘤干细胞靶向单抗或小分子抑制剂，即在患者组织水平检测联合治疗的有效性。最后，募集肿瘤晚期耐药患者开展临床实验，评估联合治疗方案的安全性和有效性。
四、总体研究方案
学术思路：
本项目以解决临床上结直肠癌生存率低、复发率及转移率高的难题为着眼点，从肿瘤发展迅速且多药耐药的结直肠癌患者标本出发，通过比较其与其他恶性程度较低的肿瘤组织基因表达差异，根据肿瘤干细胞本身干性强、高耐药的特点，筛选出可能的肿瘤干细胞新标记分子。此后，在细胞、类器官和动物水平验证筛选出的阳性细胞符合肿瘤干细胞的特性，并进一步揭示基因ABC对肿瘤干细胞干性和耐药性维持的分子机制。根据上述机制研究，找到基因ABC产物的特异性抗体或其信号通路的小分子抑制剂，阻断基因ABC对肿瘤干细胞的作用，从而实现对肿瘤干细胞的精准杀伤。在靶向治疗解除了肿瘤干细胞对传统疗法抵抗的情况下，结合传统放化疗或免疫疗法， 实现对结直肠肿瘤的全面杀伤，最终达到彻底治愈肿瘤的目的。
技术途径：
创新性：
肿瘤干细胞在肿瘤发生发展以及对治疗敏感性的影响收到广泛关注，但目前研究大部分局限于细胞和动物水平的研究，极少数能有效转化至临床应用。本项目从结直肠癌高复发、转移率这一临床问题出发，以临床需求导向基础研究，利用基础研究成果解决临床难题，针对结直肠肿瘤干细胞的独特生物学性质，特异性解除肿瘤干细胞在肿瘤治疗中的滞阻作用，真正实现转化医学与精准医学互作互助，为彻底治愈结直肠癌提供了新的机会。
技术层面，本项目通过直接比较不同进展及药物敏感性的肿瘤组织与恶性程度较低的肿瘤组织，从患者标本得到最直接的差异数据。结合目前最新的肠道组织类器官培养、crispr cas9基因修饰技术、体内示踪系统和条件性敲除小鼠体系，从细胞、组织、动物、患者四个层面对肿瘤干细胞在肿瘤发生发展及治疗中的作用进行全面系统地分析，与此同时，结合肿瘤干细胞靶向治疗和传统放化疗及免疫疗法，形成全方位结直肠肿瘤治疗新策略。
可行性分析：
1. 研究基础：结直肠肿瘤干细胞目前已有一些标志分子，包括CD133、CD44、CD166、ALDH1、CD29、CD24、ESA和Lgr5等，这些分子为本项目提供了前导基础。×××医院丰富的结直肠癌诊疗资源为项目实施提供了可能性，包括患者肿瘤进展、药物敏感性评估等信息的收集，肿瘤样本组织的获取等。最新研究利用肠道类器官培养体系，已经形成了较为稳定的药物筛选和体外成瘤模型，为本项目提供了有力的技术支撑。
2. 研究团队：……
3. 技术平台：……
五、项目计划目标
总体目标：
1. 发现结直肠肿瘤干细胞特异性新标志分子；
2. 揭示肿瘤干细胞对结直肠癌发生发展及药物抵抗影响的分子机制；
3. 形成肿瘤干细胞靶向治疗与传统放化疗及免疫治疗相结合的联合结直肠癌治疗新策略；
4. 探索基础研究与临床应用相辅相成的快速转化医学新理念。
预期目标：……