组织学

组织学的研究内容

组织学（histology）是研究正常机体微细结构（显微镜下的结构）及其相关功能的科学，内容包括细胞、基本组织、器官与系统。
细胞（cell）是机体结构与功能的基本单位。
组织（tissue）是由形态、功能相同或相似的细胞和细胞外基质组成的群体结构，是构成器官的基本成分。人体有四种基本组织：上皮组织、结缔组织、肌组织和神经组织。
器官（organ）具有一定的形态结构，并执行特定的生理功能。中央有大空腔的器官称空腔性器官，如血管、消化管等；无大空腔的器官称为实质性器官，如肝、肾等。
系统（system）由一些结构连续、功能相关的器官组成，完成连续的生理活动。如消化系统、呼吸系统、循环系统等。

组织学的研究方法

组织学研究的是微细结构，必须在显微镜下才能观察清楚。显微镜有光学显微镜（lightmicroscope，LM，简称光镜）和电子显微镜（electronmicroscope，EM，简称电镜）。

组织学研究方法

一、一般光学显微镜技术

要研究机体的组织结构，必须将要观察的材料制备成很薄的样本并进行染色，方可在显微镜下观察。光学显微镜下所见结构，简称光镜结构。光镜的分辨率约为 0.2 μｍ，可放大约 1500 倍。

切片法

• 石蜡切片法
  石蜡切片法（paraffin sectioning）是最常用的技术，其基本程序如下：取材、固定、脱水、包埋、切片、染色、封片。
  最常用的染色法是苏木精-伊红染色法（hematoxinlin-eosin staining），简称HE染色法。苏木精为碱性染料，某些酸性物质（如胞核内的染色质、胞质内的核糖体等）与碱性染料亲和力强，称为嗜碱性（basophila），着紫蓝色；伊红为酸性染料，细胞质及细胞外基质中的碱性成分与酸性染料亲和力强，称嗜酸性（acidophilia），着粉红色；若与两种染料的亲和力都不强，则称中性（neutrophilia）。
  除HE染色法外，还有多种染色方法。如银染法，用硝酸银染色时，有些组织结构可直接使银离子还原为银颗粒而呈黑色，称亲银性（arrgentaffin）；有些组织结构需添加还原剂才能使硝酸银还原，称嗜银性（argyrophoia）。
  有些结构染色后所呈现的颜色与所用染料的颜色不同，如甲苯胺蓝染色肥大细胞时，其颗粒显示为紫红色，称为异染性（metachromasia）。
• 除石蜡切片法外，尚有冷冻切片法
  即应用液氮、低温制冷装置和恒冷切片机将组织迅速冷冻并切片，常用于不稳定活性物质的研究和快速病理诊断。

非切片法

血液和脑脊液等液体样本，可直接在载玻片上涂片，干燥后再进行固定和染色，称涂片法。
疏松结缔组织和肠系膜等软组织，可在载玻片上撕开展平，制成铺片，待干燥后进行固定和染色，称铺片法。
骨和牙等坚硬组织可直接磨成薄片进行染色观察，称磨片法。

二、几种特殊的光学显微镜

• １．荧光显微镜　
  荧光显微镜（fluorescence microscope）一般采用高压汞灯和弧光灯作为光源，激发生物样本中的荧光物质，产生各种荧光。利用荧光显微镜可研究自发荧光物质或带有荧光标记的物质在组织细
  胞中的分布，以达到对特定物质进行定性、定位和定量观察的目的。
• ２．倒置显微镜　
  倒置显微镜（inverted microscope）的光源和聚光器在显微镜载物台的上方，从而增大了载物台放置样本的高度，主要用于观察体外培养的活细胞，可对细胞生长情况进行连续拍摄。
• ３．相差显微镜　
  相差显微镜（phasecontrast microscope）可将活细胞内各种结构对光的不同折射转换为光密度差异（明暗差），从而使镜下结构反差明显，呈现清晰的影像。在实际应用中还可将相差显微镜和倒置显微镜制成倒置相差显微镜，用于研究体外培养活细胞的形态结构及分裂、增殖、运动等变化过程。
• ４．激光扫描共聚焦显微镜　
  激光扫描共聚焦显微镜（conforcal laser scannin g microscope，CLSM）是一种高光敏度与高分辨率的显微镜，主要由激光光源、共聚焦成像扫描系统、电子光学系统和计算机图像分析系统四部分组成。它可对较厚的组织切片进行连续精确的断层扫描，获得其内各层面的精细图像，经计算机合成处理后形成完整的三维图像。还可动态观察体外培养的活细胞，并对细胞内分子或离子进行标记，检测各种物质的表达及其动态变化。CLSM突破了普通显微镜不能对组织或细胞内部进行定位检测的局限，能够对细胞内部进行非侵入式光学断层扫描成像，是开展亚细胞水平的结构和功能研究的有力工具。

三、电子显微镜技术

电子显微镜技术简称电镜技术，是以电子束代替可见光，以电磁透镜代替光学透镜，最后将物像投射到荧光屏上观察。在电镜下可以观察到的结构，称亚微结构或超微结构。目前常用的电镜有透射电镜和扫描电镜。

• １．透射电镜　
  透射电镜（Transmission Electron Microscope，TEM）的分辨率为 0.1~0.2 nm，放大倍数为几万到几十万倍，主要用于观察组织细胞内部的平面微细结构，图像似黑白照片。用透射电镜观察的样本必须制备成超薄切片（通常厚为 50~80 nm）。其制备过程主要包括戊二醛和锇酸固定、脱水、环氧树脂包埋、超薄切片机切片、电子染色等。电子束投射到样本时，可随组织构成成分的密度不同而发生相应的电子散射，如电子束投射到质量大的结构时，电子被散射较多，因此投射到荧光屏上的电子少而呈暗像，称电子密度高（electron dense）；反之，则称电子密度低（electron lucent）。

• ２．扫描电镜　
  扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）是用极细的电子束在样本表面扫描，用特制的探测器收集产生的二次电子，形成电信号运送到显像管，在荧光屏上显示立体图像。其分辨率一般为５~７μｍ，主要用于观察组织和细胞的表面形态和立体结构。

四、组织化学技术和细胞化学技术

组织化学（histochemistry）技术和细胞化学（cytochemistry）技术是应用化学反应原理，对组织或细胞内某种物质进行定位检测的一种方法。若与显微分光光度计或图像分析仪合用，则可获得定量信息。

• １．一般组织细胞化学技术　
  其原理是在切片上加入能与组织细胞中某种待检物质发生化学反应的试剂，其最终产物或为有色沉淀物，可用光镜观察；或为重金属沉淀，可用电镜观察。常见待检物质如下：
  （１）糖类：显示细胞、组织内的多糖或蛋白多糖的常用方法是过碘酸希夫反应（periodic acicd Schiff reaction），其基本原理是，糖类可被过碘酸氧化形成二醛基，后者与无色亚硫酸品红结合，反应产物为紫红色沉淀。
  （２）酶类：每一种酶都可通过催化特定的底物产生化学反应。为证明细胞或组织中某种酶的存在和活性，先将切片放入有特异性底物的溶液中孵育，底物经酶水解或氧化形成初级反应产物；该产物再与相应的捕捉剂结合，形成不溶性、有颜色的或电子致密的反应终产物，在光镜或电镜下观察。
  （３）脂类：显示脂肪和类脂，样本常用甲醛固定，冷冻切片，油红Ｏ、尼罗蓝或苏丹类脂溶性染料染色。也可用锇酸固定兼染色，脂类呈黑色。
  （４）核酸：显示ＤＮＡ的传统方法为福尔根反应（Feulgen reaction）。切片经稀盐酸处理后，使ＤＮＡ水解，打开脱氧核糖核酸和嘌呤碱之间的连接键，暴露出醛基，再用Schiff试剂处理，使DNA呈紫红色。
• ２．免疫组织化学技术　
  组织细胞内的蛋白质与肽类均具有抗原性。将组织中待测的多肽或蛋白质作为抗原，把经过标记的、与待测抗原相对应的抗体与之反应，产生的抗原抗体复合物因被标记在显微镜下可见，从而对组织和细胞中某些多肽和蛋白质等大分子进行定位、定量分析，这种技术叫免疫组织化学技术（immunohistochemistry）或免疫细胞化学技术（immunocytochemistry）。常用的标记物有荧光素（如异硫氰酸荧光素）、酶（如辣根过氧化酶）等。该技术特异性强、灵敏度高。近年来，已被广泛用于基础研究和一些疾病的早期诊断。
• ３．原位杂交技术　
  原位杂交（in situ hybridization）技术又称核酸分子杂交组织化学技术，是在组织细胞原位进行核酸分子杂交，以检测RNA或DNA序列片段的方法。其基本原理是，两条单核苷酸链通过碱基互补原则紧密结合，形成稳定的杂交体。应用含有特定序列、经过标记的DNA或RNA片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸（RNA或DNA）片段进行杂交，便可获知是否有待测核酸及相对量。常用标记物有放射性核素和地高辛。

五、放射自显影技术

放射自显影技术（autoradiography，ARG）是通过活细胞对放射性物质（如3H、14C、32P、35S、131I等）的特异性摄入，以显示该细胞的功能状态或该放射性物质在组织或细胞内的代谢过程。将放射性核素或放射性核素标记的物质注入动物体内，让动物存活一定时间后取材、制备切片，并在其上面涂以感光材料（如感光乳胶），置暗处，细胞内放射性核素产生的射线能使乳胶感光。经显影、定影处理，可在光镜或电镜下观察，从而获知被检物质在组织或细胞内的分布、相对含量及代谢转归。

六、组织和细胞化学定量技术

• １．分光光度术　
  显微分光光度术（microspectrophotometry）是以物质分子对光波的选择性吸收为基础，应用显微分光光度计测定细胞内某种物质的光密度值（OD值），从而对细胞内化学成分进行定量分析的一门技术。如测定细胞内蛋白质、核酸、酶、脂类、糖类等的含量。
• ２．流式细胞术　
  流式细胞术（flow cytometry）是应用流式细胞仪进行细胞定量和分类研究技术，能对单个细胞及其群体的某种化学物质含量与种类作出分析。其工作原理是，分离被检细胞，并进行荧光染色或标记，然后使单细胞液流快速通过仪器的激光照射分析区，被检细胞产生不同的荧光信号并转变为电脉冲，经计算机分析获得该细胞群体中不同类型细胞的有关数据。该技术快速、精确、灵敏。
• ３．显微图像分析系统　
  显微图像分析系统（micro image analysis system）主要由四部分组成：显微镜、图像采集装置、计算机和数据分析软件。该系统应用数学、统计学等原理，对被观察切片所提供的数字图像进行处理，根据图像像素大小、位置、灰度等信息，以获得组织和细胞内成分的数量、体积、直径以及表面积等参数。此外，该系统还可将平面图像中获得的某种结构成分的二维信息通过计算机转换成三维数据，从而得以了解该结构成分的立体图像，也称为体视学（stereology）。

七、体外培养技术

体外培养技术包括组织培养（tissue culture）技术和细胞培养（cell culture）技术，是指从机体取得的活组织或活细胞在体外一定环境条件下进行培养并进行实验的技术。体外培养一般在CO2培养箱中进行，培养环境无菌，要有适宜的温度、O2与CO2浓度、pH等条件，培养液要含有适合细胞生长的营养物质、生长因子、激素等。组织培养常用的容器有培养瓶、培养皿、培养板等。在倒置相差显微镜下可直观细胞的增殖、分化、运动、吞噬等动态变化，并可用显微录像或显微摄影真实地记录下活细胞的连续变化过程。应用此技术可研究各种因素对活细胞的影响，获得单纯体内实验难以达到的效果。
组织工程（tissue engineering）是用细胞培养技术在体外模拟构建机体组织或器官的技术。目前正在研究构建的组织器官主要有皮肤、软骨、骨、肌腱、骨骼肌、血管及角膜等；其中以组织工程皮肤的研究较为成功并已应用于临床治疗烧伤、皮肤静脉性溃疡等疾病。

参考资料：
王亚平,周雪. 组织学与胚胎学(第二版)[M]. 北京：科学出版社, 2016