MultiQC

MultiQC用于对测序数据进行质量评估，但它不同于FastQC之类的软件，FastQC只能对单个样本进行评估生成报告，而MultiQC能将fastqc生成的多个报告整合成一个报告（HTML和PDF格式），方便的查看所有测序数据的质量，同时还支持多种分析类型的质控结果查看，如：RNAseq、Whole-Genome Seq、Bisulfite Seq、Hi-C和MultiQC_NGI等。

安装

MultiQC的使用基于Python，所以需要先安装conda和pip，因为我之前已经安装好了，所以这里直接安装MultiQC

conda install -c bioconda multiqc
multiqc .

结果

3.PNG

运行

当前文件夹下有两个待分析的fq.gz文件

4.PNG

先用fastqc进行质量控制

fastqc test_7942raw_1.fq.gz test_7942raw_2.fq.gz
ls  ##查看产生的新文件

结果

5.PNG

.html文件可以下载到window版本下用浏览器打开查看，它是fastqc分析的结果

接下来我们用multiqc分析用之前的fastqc分析出来的fq.gz文件

multiqc test_7942raw_1_fastqc.zip test_7942raw_2_fastqc.zip

结果

6.PNG

7.PNG

我们将multiqc_report.html 下载到本地用浏览器查看

结果分析

一 .General Statistics:质量评估整合统计表
%Dups：重复reads的比例
%GC：GC含量占总碱基的比例，比例越小越好
M Seqs：总测序量（单位：millions）

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二 .FastQC

1 .Sequence Quality Histograms ：每个read各位置碱基的平均测序质量

横坐标：碱基的位置

纵坐标：质量分数，质量分数=-10log10p（p表示错误率），当质量分数为40的时候，p=0.0001。此时说明测序质量非常好。

fastqc_per_base_sequence_quality_plot.png

当曲线在绿色区间时说明数据质量非常好，橙色区间说明数据质量一般，红色区间说明数据质量不合格。可以看到我们的数据质量很好。

2 .Per Sequence Quality Scores：具有平均质量分数的reads的数量

横坐标：平均序列质量分数

纵坐标：reads数

10.png

当曲线在绿色区间时说明数据质量非常好，橙色区间说明数据质量一般，红色区间说明数据质量不合格

3 .Per Base Sequence Content ：所有reads各位置碱基ATCG的分布

横坐标：碱基位置

纵坐标：碱基含量（%）

11.PNG

正常情况下每个位置每种碱基出现的概率是相近的，四条线应该平行且相近。当部分位置碱基的比例出现偏离bias（偏离）时，即四条线在某些位置纷乱交织，往往提示我们有overrepresented sequence的污染。当所有位置的碱基比例一致地表现出bias时，即四条线平行但分开，往往代表文库有bias，或者是测序中的系统误差。比如在我们样本的开头就可能存在overrepresented sequence污染。

A/T比例与G/C比例在任何位置的差值大于10%——warning
A/T比例与G/C比例在任何位置的差值大于20%——fail

4 .Per Sequence GC Content ：reads的平均GC含量

横坐标：GC含量百分比

纵坐标：数量

fastqc_per_sequence_gc_content_plot.png

正常的样本的GC含量曲线会趋近于正态分布曲线，曲线形状的偏差往往是由于文库的污染或是部分reads构成的子集有偏差造成的。

5 .Per Base N Content ：每条reads各位置N碱基含量比例

横坐标：read中的位置

纵坐标：N的数量比

fastqc_per_base_n_content_plot.png

当测序仪器不能辨别某条reads的某个位置到底是什么碱基时，就会产生“N”，对所有reads的每个位置，统计N的比率。正常情况下，N值非常小。我们的结果中显示N值只在开头有，并且值很小。

6 .Sequence Length Distribution：reads长度分布

从结果可以看到我们reads的长度为150bp

12.PNG

当reads长度不一致时报”WARN”；当有长度为0的read时报“FAIL”。

7 .Sequence Duplication Levels：每个序列的相对重复水平

横坐标：每个序列的相对重复水平

纵坐标：在文库中的比例

fastqc_sequence_duplication_levels_plot.png

测序深度越高，越容易产生一定程度的duplication，这是正常的现象，但如果duplication的程度很高，就提示我们可能有bias的存在。再结合前面的质量分析来看我们的reads开头的质量不是很好。

8 .Overrepresented sequences：文库中过表达序列的比例

overrepresented sequences:某个大量出现的序列

13.PNG

一个转录组中有很多的转录本，一条序列再怎么多也不太会占整个转录组的一小部分（比如1%），如果出现这种情况，不是这种转录本巨量表达，就是样品被污染。可以看到我们的结果显示Overrepresented sequences的比例<1%

9 .Adapter Content 接头含量

横坐标：碱基位置

纵坐标：接头占序列的百分比，>5%——warning，>10%——fail

fastqc_adapter_content_plot.png

从结果看我们的reads的接头含量理想。如果结果不理想后续我们还需要去除接头和质量不好的reads，去污染等操作来进行数据过滤。

遇见的问题

multiqc .指令需要在fsatqc的文件夹下执行，否则会报错。如图

1.PNG

2.PNG

参考资料:
MultiQC使用指导
整合QC质控结果的利器——MultiQC
Multiqc（转录组分析之质量评估）