2022-01-12 感受态细胞转化实验

转化：转化指同源、异源的“裸露”的DNA分子被感受态细胞摄取并实现基因水平转移的过程。是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-, M-)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。

质粒：存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。

原理 大肠杆菌经过处理后可以摄取外源DNA（Plasmid DNA、Phage DNA等），处于这种状态的细胞称为感受态细胞（Competent Cell）。在基因工程实验中，经常要使用各种感受态细胞进行DNA的转化操作。正在生长的大肠杆菌在0°C下加入到低渗的冰冷的CaCl2溶液中，便会造成细胞膨胀成球（感受态细胞）；感受态细胞与外源质粒DNA形成一种黏着在细胞表面上的对DNA酶抗性的羟基磷酸钙复合物。 42°C下作短暂的热刺激期间，这种复合物便会被细胞吸收。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子。

用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。这种转化方法称为“化学法”。目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。

步骤

（1）感受态细胞的制备

1）挑取大肠杆菌划线于LB平板上，在37℃恒温培养过夜(16-18h)。

2）挑取单菌落于50mL LB培养基中37℃、200 r/min培养3-4h，至出现薄雾状菌悬液即可。

3）将培养液置于冰上预冷15min，并间断轻轻摇动。

4）将冷却的培养液倒入己在冰上预冷的50mL离心管中。

5）在冷冻离心机中离心，4℃ 3000r/min离心 5min。

6）弃上清、加入15mL冰上预冷的0.1mol/L CaCl2溶液,轻轻旋转，使细胞充分重新悬浮，冰上放置20-30min。

7）于4℃ 3000r/min离心5min。

8）弃上清，加入2mL冰上预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，轻轻旋转，使细胞充分重新悬浮，5min后就可以用于转化实验，或添加保护剂，低温或超低温冷冻贮藏备用。

（2）感受态细胞的DNA转化

1）取100 µl的感受态细胞置于冰中融化20-30分钟。

2）于超净台中取质粒1μl（2ng/μl）与100μl大肠杆菌感受态细胞混合，置冰浴中30分钟。

3）42℃水浴中热激90秒钟后，立即于冰中放置5分钟。

4）加入0.9 ml 37℃预温的LB培养基，在37℃ 200r/min温育30-45分钟。

5）将菌液1000rpm/min离心2min，取80μL均匀涂布在含有适量抗生素的琼脂平板表面，平板于37℃倒置培养过夜，观察实验结果并记录。

注：新倒的平板可于37℃培养箱中预先放置数小时至过夜干燥

注意：

1. 制作感受态细胞时应使用专用的玻璃器皿或塑料容器。洗刷这些玻璃器皿或塑料容器时应尽量洗净。由于微量的洗涤剂或污染物都可能降低感受态细胞的转化效率，因此在洗刷完用于制作感受态细胞的专用玻璃器皿或塑料容器后，最好用去离子水浸泡一晚，然后再充分洗净。

2. 制作感受态细胞时使用的菌种，不应使用4℃或常温保存的传代细菌。应使用-70℃保存的菌种，在 LB抗生素平板培养基上分级划线培养后，挑取单菌落。使用这种菌种制作的感受态细胞，能提高转化效率。

3. 菌体的浓度是影响感受态效率高低的主要因素，适于本法的菌体浓度应在OD600值0.05-0.11之间。

4. 用于感受态细胞制备的菌体培养停止后要立即处理，不要将培养液过长时间室温放置，在冰中放置时也不要时间过长。

5. 感受态细胞的制备操作过程中，离心后弃上清时要尽量弃尽，否则会降低感受态细胞的转化效率。

6. 主要的转化操作都是无菌操作，并且在冰上进行。